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    公开号:WO1986003779A1
    申请号:PCT/JP1985/000696
    申请日:1985-12-19
    公开日:1986-07-03
    发明作者:Hideo Ohgai；Hiroshi Momota；Takeshi Kumakura；Noriyuki Kajifusa；Toshiki Kitazawa；Kazuhide Oshiden；Aizo Matsushiro
    申请人:Earth Chemical Company, Limited；
    IPC主号:C07K14-00
    专利说明:
    [0001] 明 細 ポ リ ペプ チ ド分泌発現ベ ク タ ー 、 該ベ ク タ 一 で形質転換 し た微生物及び該微生物 に よ る ポ リ ペプチ ド の製造
    [0002] 技 術 分 野
    [0003] 本発明 はポ リ ペプチ ド分泌発現用 ベ ク タ ー 、 該ベ ク タ 一 で形質転換 し た微生物及び該微生物 に よ る ポ リ ぺプチ ドの製造に 関 す る
    [0004] 背 景 技 術
    [0005] 遺伝子 工学的手法を用 い て 、 イ ン タ ー フ ェ ロ ン 、 成長 ホルモ ン等を始め と す る様々 なポ リ ペプチ ドを大腸菌,、 枯草菌 、 酵母等の宿主細胞の利用 に よ り 製造す る方法 は 既 に 確立さ れて い る 。 し か し なが ら 確立さ れた 方法 と い え ど も未だ幾つ かの未解決の 問題点を有 し て お り 、 天然 品 と 全 く 同一 の ポ リ ペプチ ド を製造す る こ と は必ず し も 容易 で は な い 。 上記問題点の 中で最も重要な も の の ひ と つ と し て は 、 ポ リ ペプチ ド の N 末端を 、 天然品 と 周一の 構造 と す る の が困難な こ と を挙げる こ と がで き る 。 即 ち 之等の ポ リ ペプチ ドを コ ー ド す る遣伝子を宿主細胞内で 直接発現 さ せ る と き 、 遺伝子か ら ポ リ ペプ チ ド への 翻訳 は 、 通常開始 コ ド ン （ A T G ) か ら 始 ま る た め 、 発現さ れるポ リ ペプチ ドの N 末端は 、 ホル ミ ルメ チ才ニ ン残基 と なっ て し ま う 。 天然型ポ リ ペプチ ドの N 末端が ホル ミ ルメ チ才ニ ンであ る場合は少な く 、 他の N 末端を有する ポ リ ペプチ ド の製造に は こ の方法は利用 で きない 。 上記 ホル ミ ル メ チ才ニ ン残基 は 、 シ ァ ノ ゲ ンブ ロ マイ ドを用 い た化学反応に よ り ポ リ ペプチ ドか ら 除去す る こ と が で きる が 、 ポ リ ペプチ ドが N 末端の他 に もメ チ才 ニ ン残基 を有す る場合、 上記方法で は ポ リ ペプチ ド鏆自体が該個 所で切断さ れて し ま い 、 や は り 目 的の ポ リ ペプチ ド は製 造で きな い 。
    [0006] ま た 目 的ポ リ ペプチ ド を コ ー ドす る遺伝子を 、 他の ポ リ ペプチ ド を コ ー ド する遣伝子 と結合さ せて 、 融合ポ リ ペプチ ド と し て 発現させ る方法も知 ら れて い る の方 法で は 、 得 ら れる融合ポ リ ペプ チ ド か ら の 目 的 ポ リ ぺ プ チ ド の分離は 、 卜 リ プシ ン等の酵素に よ る処理や シ ァ ノ ゲ ンブ ロ マイ ド等を用 い た化学的処理 に よ っ て い る 。 し か し な が ら こ の方法 に お いて も 目 的のポ リ ペプチ ド鎖内 に使用 す る酵素又 は化学薬品 の標的 と な る ア ミ ノ 酸が存 在 す れば 、 そ の個所でペプチ ド鎖が切断さ れ 、 結局 目 的 ポ リ ベ プ チ ド は 製造 はで き な い 。 ま た 、 上記方法に よ り 融合ポ リ ペプチ ド か ら の 目 旳ポ リ ペプチ ド の分離が可能 な場合 と い え ども 、 目 的ポ リ ペプチ ド の単離のた め に は 通常菌体粗抽出液か ら 融合ポ リ ペプチ ド を分離す る 工程 及び融合ポ リ ペプチ ド を 切 断 し た反応組成物か ら 目 的ポ リ ペプチ ド を分離す る 工程の 2 回 の精製操作が必要と な り 、 そ の操作及び工程自体煩雑 と な り 、 し かも 目 的物 の 収率の低下 は避け ら れな い 。
    [0007] 以上の よ う に 、 天然型 と全 く 周一の ポ リ ペプチ ドを遣 伝子 工学的手法で入手す る こ と は 、 従来非常に 困難で あ り 、 こ の天然型 と 全 く 同一の ポ リ ペプチ ド を宿主細胞か ら 直接製造で き る改良さ れ た方法の研究開発が 、 斯界で 要望さ れて い る現状 に あ る 。
    [0008] 本発明 は 、 上記斯界で 要望 さ れて い る天然型 と 全 く 周 一 の ポ リ ペプチ ド を宿主細胞か ら 直接製造でき る改良さ れた 方法を提供す る こ と を 目 的 と す る 。 ま た本発明 は 、 該方法の実施の た め の新 し い ベ ク タ ー 及び該べ ク タ 一 を 保有す る微生物 を提供す る こ と を も そ の 目 的 と し て い る 発 明 の 開 示
    [0009] 本発明 に よ れば、 シ グナルペ プ チ ド を コ ー ド す る D N A 塩基配列 と 目 的ポ リ ペプチ ド を コ ー ド す る D N A 塩基配列 と を直接連結 さ せ て 目 的ポ リ ペプ チ ド を分泌発 現さ せ る た め の 、 シ グ ナルペプチ ド を コ ー ド す る D N A 塩基配列を含む こ と を特徴 と する ポ リ ペプチ ド分泌発現 用 ベ ク タ ー 、 シグナルペプチ ド を'コ ー ド す る D N A塩基 配列 と 目 的ポ リ ペプチ ドを:コ ー ド する D N A塩基配列 と が直接連結さ れ て な る融合ポ リ ペプチ ドを コ一 ド す る D N A塩基配列 を含む上記ベ ク タ ー 、 該ベ ク タ ーで形質 転換さ れた微生物及び該微生物 を培養 し て 分泌 さ れる ポ リ ペプチ ド を採取する ポ リ ペプチ ド の製造法が提供さ れ る 。
    [0010] 本明細書に おいて 、 ア ミ ノ 酸 、 核酸塩基、 その他 に 関 し て 略号で表示す る場合 は I U P A C、 I U Bの規定或 い は当該分野 に お け る慣用 記号 に従 う も の と し 、 そ の例 を次に 挙げる 。
    [0011] S er： セ リ ン し eu； ロ イ シ ン
    [0012] A rg ； アル ギ ニ ン C ys； シ ステ ィ ン
    [0013] G in ; グルタ ミ ン I le ; イ ソ ロ イ シ ン
    [0014] P ro； プ 口 リ ン V al ； バ リ ン
    [0015] H is ; ヒ ス チ ジ ン et ; メ チ才ニ ン
    [0016] A la； ァ ラ ニ ン P he； フ エ 二 ル ァ ラ ニ ン
    [0017] G ly； グ リ シ ン A sp； ァスパ ラ ギ ン酸
    [0018] A sn； ァ スパ ラ ギ ン
    [0019] A ； ア デニ ン T '· チ ミ ン G ； グ ァ ニ ン C ； シ 卜 シ ン
    [0020] シ グナルペプチ ド と は 、 細胞内で生産さ れた ポ リ ぺプ チ ド を細胞外 に分泌する働き を する ア ミ ノ 酸配列で ある 一般 に微生物 に 瑕 ら ず 全て の細胞の生産す る ポ リ ぺ プチ ド に は 、 細胞内 に 留 ま っ てそ の働き をな すも の と 、 細胞 外 に分泌 さ れる も の と が あ る の細胞外 に分泌さ れる ポ リ ペプチ ドで は 、 ま ず 、 そ の N 末端 に 十数個乃至数十 個 の ア ミ ノ 酸配列 か ら な る シ グナルペプチ ドが付加 さ れ た 前駆体 と し て細 胞内 に生産さ れ 、 次いで該前駆体 はそ の有 す る シグナルペ プ チ ド の作用 に よ り 該 シグ ナル ぺプ チ ド を介 し て 細胞膜を通過する と周 時 に シ グナルぺプチ ダー ゼ の作用 に よ り シ グナル ペプチ ド が 切 り 離 さ れ 、 そ の結果一切 の不要 ア ミ ノ 酸を 持た な い 目 的 ポ リ ペプチ ド の みが 細胞外 に 分泌 さ れる （ 以下 、 こ の よ う に細胞外 に 分泌 さ れる 目 的ポ リ ペプチ ド を 「 成熟ポ リ ペプチ ド 」 と い う ） 。 冽 えば 、 大腸菌の 3 ラ ク タ マ ー ゼ は 、 菌体内で β ラ ク タ マ — ゼ前駆体 、 即 ち 3 ラ ク タ マ ー ゼ と 2 3 個 の ア ミ ノ 酸か ら な る シ グ ナルペ プチ ド と の融合蛋 白 質 と し て 生産 さ れた 後 、 該シ グナルペプチ ド の作用 に よ り 細胞 膜を通過 し て ペ リ プ ラ ス ム 、 即 ち 細胞膜 と 外膜 と の 間 の 空 間 に 分泌 さ れ 、 そ の際 、 シ グ ナルペプチ ド は 、 シ グ ナ ルぺプチダーゼ に よ り 切断され、 ペ リ ブラズム内 に は成 熟'ポ リ ペ プチ ド 、 即 ち 活性型の /3 ラ ク タ マ ー ゼが蓄積さ れる こ と が知 ら れている 〔 J . G . S utc I i f f e, P roc. N atl . A cad. S ci . U S A , 7 5 , 3 7 3 7 - 3 7 4 1 ( 1 9 7 8 ) 〕 。
    [0021] 本発明者 ら は 、 上記シグナルペプチ ドの特性 に着目 し 該シグナルペ プチ ドを利用 し て 、 目 的 と する外来蛋白質 を シグナルペプチ ド と の融合ポ リ ペプチ ド と し て宿主賴 胞内で生産さ せるこ と に よ り 、 外来蛋 白質を細胞外に成 熟ポ リ ペプチ ド と して分泌させ 、 か く し て 目 的ポ リ ぺプ チ ド を容易 に 製造入手 し得る と の着想か ら鋭意研究を重 ね た 。 そ の結果 、 実際に宿主細胞内 に導入 する こ と に よ つ て 、 目 的ポ リ ペプチ ド を成熟ポ リ ペプチ ド と し て 細胞 外 に 分泌さ せ得る新 し い ベ ク タ ー （ プラ ス ミ ド ） 及ぴ該 ベ ク タ ー のた め の ポ リ ペ プチ ド分泌発現用 ベ ク タ ー の構 築に 成功 する と共 に 、 こ のベ ク タ ー の利用 に よ る 目 的ポ リ ペプチ ド の 製造 に成功 し た 。
    [0022] 本発明 の ポ リ ペプチ ド分泌発現用 ベ ク タ ー は 、 目 的ポ リ ペ プチ ドを コ ー ド す る D M A塩基配列を直接連結でき る よ う に設計さ れた シ グナルペプチ ド を コ ー ド す る
    [0023] D N A塩基配列 を保有 し て い る 。 従っ て 該ベ ク タ ー に は 5 「 ¾ ¾ ¾ v Ν α ¾止 ） er 33 ½ ^ 籙 / ) ύ 養 gf V N Cl ^ ^ — に W ^ ^ ^ ^ ¾
    [0024] ( し 〉
    [0025] B I V ~9t) d - I B Λ - oj d - ηθ η —SA O -θ^ d
    [0026] - B I V - B I V一 sij d - 9 d - 0 J d - Θ - ΠΘ η - e I V
    [0027] - |B A -6J V -3 d - si H - u| 0 -θ| I - J θ S - 19 l!
    [0028] ° § _! っ ^ ½ 2i缀 , ^ gi ： 1 ( し ） si a丄 t) ^ i ^ ^( - , ^ ° § i マ § ^ W ^ Ci> *4— 雇割 ¥ ^ ^ 、
    [0029] ^ ^ ^ m ^ Q) ji ^ ^( - ^ ^ ° ¾ $ マ
    [0030] Φ ¾ ¾ <^、 ¾ W 、 4 ^ ^ ^ § 1 W
    [0031] 5 t¾ ) ^ ¾ ¾ 、 ？1 1 っ 「 31誓 ¾ 0 § ー に ¾ 0L ： ぉ簦 ^譜彰 ー ^ ½ ¾ $
    [0032] ° § 4 i ¾ ^ c 1 ¾ ¾ ^濡 一 ^ : y ¾ ¾ $ 、 土） o
    [0033] D ^ ^ i ？ ^ !> §
    [0034] A $ if ¾ ¾ ^ 1 つ ；？ d ^ Γ ^ ^ 、 ·^ Γ
    [0035] 目 ： 1マ Π Χ ¼ §Ι腺 ： I C ： 1驀 ¾ 0) 1(腺 ΐ雞 5
    [0036] 、 0) ^ ：2 §：& $ ¾ ¾葛 ^ : I つ Υ ¾ : ^ 翊腺 S ¾ W ：
    [0037] 1 - ^ ^ ¾ §- x n > ^ $ α ^？ ^ $ ¾虽 ^ ¾養 ¾ V N d d — に ¾ d 4厶 Γι Μ 目 ¾ 環 ：1 21 ¾翳 ¥ (] ー 1= ^、^ ： ^ ^ 0) 一 L
    [0038] 96900/S8df/l3d 6ムム£0/98 Ο 任意 に選択する こ と ができ る 。 尚 、 下記 D N Aは 、 メ チ ル化等の常法 に従い俊飾さ れた塩基を も含むも の と す る M et ; A T G '
    [0039] S er : T C丁 、 T C C、 T C A、 T C G、 A G丁 、
    [0040] A G C
    [0041] I le : A T丁 、 A T C、 A T A
    [0042] G in ; C A A、 C A G
    [0043] H is ; C A T . C A C
    [0044] P he ; T T T , T T C
    [0045] A rg : A G A、 A G G、 C G丁 、 C G C、 C G A
    [0046] C G G
    [0047] V a G T丁 、 G T C G T A、 G T G
    [0048] A I a G C 丁 、 G C C、 G C A、 G C G
    [0049] L eu ; T T A , T T G、 C T丁 、 C T C 、 C T A
    [0050] C T G
    [0051] P ro : C C T、 C C C 、 C C A 、 C C G
    [0052] C ys ; T G T , T G C
    [0053] 上記 D N A塩基配列の う ち で 、 特に 好 ま し く 選択さ れ た組合せ と し て は 、 下記式 （ 2 ) に 示すも の を例 示で き る 。
    [0054] A T G A G T A T T C A A C A T T T C C G T G T C G C C C T T A T T C C C T T T T T T G C G G C C T T T T G C C T T C C T G T C T T C G C G
    [0055] ( 2 ) ま た本発明 ベ ク タ ー に 保有さ れる シ グナルペプチ ド を コ ー ド す る D N A塩基配列 は 、 上記の如き具体'的 D N A 塩基配列 を基本 と し て 、 そ の 3 ' 側付近 、 即 ち こ れ に 目 的ポ リ ぺプチ ド が連結さ れる側付近、 好 ま し く はそ の 0 塩基以内 に 、 又 は こ れ に 更に Ί 0 塩基以内 の D N A 配列 を付加 し て こ の付加部分 に 、 制 限酵素認識配列 を含 ま せ る も の と す る 。 こ れ は上記 シ グ ナルペプチ ド を コ ー ド す る D N A塩基配列 と 、 目 的ポ リ ペプチ ド を コ ー ド す る D N A 塩基配 列 と を 直接連結 さ せ る た め に 必須の も の で あ る 。 し か し て こ の 制 限酵素認識配列 を認識す る酵素 と し て は 、 公知 の制 限酵素の い ず れで も よ い が 、 好 ま し く は 5 塩基以上の塩基配列 を 認識す るも の が よ く 、 こ の 酵素に応 じ て 上記 3 ' 側付近の D N A塩基配列 は 、 任意 に 変化さ せ る こ と がで き る 。
    [0056] 例 え ば 、 上記具体的例示の 3 ラ ク タ マ ー ゼ の シ グ ナル ペプチ ド を 例 に と り 詳述すれば 、 そ の C端の ア ミ ノ 酸で あ る A laを コ ー ド す る 塩基配 列 と し て 、 G C C を選択 し た 場 合 、 更 に こ れ に G (3 G の 塩基配列 を連結さ せ れば 、 こ の G C C G G Cの 6塩基配列 は 、 制 眼酵素 N ael に よ り 認識さ れる 。 該シグナルペプチ ド を コ ー ド す る D N A 塩基配.列 は 、 N ae I に よ り その 中央で切断さ れ 、 か く し て 3 ' 末端が G C C ( シグナルペプチ ド の C端 ア ミ ノ 酸 A laに対応する ） であ る D N Aが得ら れ、 該 D N Aに は そ の 直後に 目 的ポ リ ペプチ ド を コ ー ド する任意の D N A 塩基配列を直接連結させる こ と ができ る 。
    [0057] ま た 例 え ば、 上記シグナルペプチ ド C端の 2 つ の ア ミ ノ 酸配列を構成する P he— A I aを コ ー ドする塩基配列 と し て 、 T T C G C Gを選択 す る場合、 そ の 3 ' 側 に 更 に アデニ ン塩基 （ A ) を連結させ て得 ら れる 7塩基配列 ( T T C G C G A ) の う ち 、 T C G C G Aは制 限酵素 N rul に よ り 認識 さ れ 、 こ の中央で切断さ れ 、 こ れ に よ り 得 ら れる D N A塩基配列 は 、 その 3 ' 末端が T T C G と な る 。 シグナルペプチ ドを コ ー ド する D N A塩基配列 と し て 、 し の塩基配列を利用 す る と き に は 、 こ れ と 連結 すべ き 目 的 ポ リ ペプチ ド を コ ー ド す る D N A塩基配列の 5 ' 側 に 、 更 に C T、 C 〇 、 C A又 は C Gの 2塩基配列 を付加 する こ と に よ り 、 所望の融合ポ リ ペプ チ ド を コ ー ド す る D N A塩基配列 が得 ら れる 。
    [0058] 更 に例 え ば、 上記 シグナルペプチ ド を コ ー ド する D N A塩基配列の 3 ' 側 に 、 A A C T C A G C T G の 1 0 塩基配列 を連結さ せ れば、 こ の配列中の 6 塩基配列 ( C A G C T G ) は 、 P vu l に よ り 認識さ れ、 そ の 中央 で切 断さ れる 。 か く し て 得 ら れる D N A塩基配列 は 、 シ グナルペプチ ドを コ ー ド す る D N A塩基配列 の 3 ' 側 に 更に A A C T C A Gの 7 塩基配列 が結合さ れた も ので あ り 、 こ の 7 塩基配列の う ち 、 最初の 3 塩基配列 A A C は A snを コ ー ド し て お り 、 次の 3 塩基配列 T 〇 A は S erを コ ー ド し て お り 、 最後の グ ァ ニ ン （ G 〉 は 、 A i a、 G ly V al、 A sp又 は G I nを コ ー ド す る コ ド ンの第 " 1 塩基で あ る 。 従っ て こ れを 、 シ グナルペプチ ドを コ ー ド す る D N A塩基配列 と し て 用 い る と き に は 、 例 え ば 3 ゥ ロ ガ ス 卜 ロ ン等の よ う に N 末端 ア ミ ノ 酸が A sn— S er— A sp で あ る ポ リ ペ プ チ ド を コ ー ド す る D N A塩基配列 か ら そ の 5 ' 側 の 7 塩基配列 （ 例 え ば A A C T C A G ) を 除い た D N A塩基配列 を結合さ せる こ と に よ っ て 所望の融合 ポ リ ペプチ ド （ 3 ゥ ロ ガ ス 卜 ロ ン と シ グナルペプチ ド と の 融合ポ リ ペプ チ ド ） を コ ー ド す る D N A塩基配列 を容 易 に 形成さ せ る こ と が で き る 。
    [0059] 従っ て 、 本発明 ベ ク タ ー の構成要素 と す る シ グ ナル ぺ プチ ド を コ ー ド す る D M A塩基配列 と し ては 、 前記 に 具 体的 に例示 し た D N A塩基配列 の他 に 、 例えばこ れに更 に 1 0個以内 の D N A塩基配列 を付加させ た も の をも 、 好 ま し いあの と し て利用 する こ と ができる 。 そ の一具体 例 は 、 上記 し た Ί 0塩基配列を付加 さ せた 下記式 （ 3 ) に 示す D M A塩基配列を有するも のである 。
    [0060] A T G A G T A T T C A A C A T T T C C G T G T C G C C C T T A T T C C C T T T T T T G C G G C C T T T T G C C T T C C T G T C T T C G C G A A C
    [0061] T C A G C T G ( 3 ) 本発明 に お け る上記シグナルペ プチ ド を コ ー ド する
    [0062] D N A塩基配列又 は こ れを含む塩基配列 は、 従来公知 の 各種の方法、 例 え ば こ れを含有す る微生物 、 そ れか ら 単 離 さ れたプラ ス ミ ド等、 好 ま し く は例 えば p B R 3 2 2 等か ら制 限酵素等を利用 し て 切 断単離す る方法 、 そ の D N A塩基配列 に従い化学合成する方法、 之等の方法の 組合せ等 に よ り 容易 に 製造する こ と がで き る 。 ま た 上記 シ グ ナルペプチ ド を コ ー ドする D N A塩基配列 と 、 目 的 ポ リ ペ プ チ ド を コ ー ド す る D N A塩基配列 と の連結乃 至 結合手段も 、 従来公知の各種方法 、 例 え ば T 4 D N A リ ガ ー ゼ等を用 い る酵素反応等 に 従 う こ と がで き る 。
    [0063] 上記の ご と く し て得 ら れる シグナルペプチ ド を コ ー ド す る D N A塩基配列 を含む本発明ベ ク タ ー は 、 該 D N A 塩基配列 を 、 例 え ばプ ラ ス ミ ド 、 ウ ィ ルス D N A 、 コ ス ミ ド 〔 例え ば p J B 8 、 I sh- H orowicz, D and B urke, J . F . , N ucleic A cids R es. , 9 ,
    [0064] 2 9 8 9 ( 1 9 8 1 ) 〕 等の従来よ り 外来遣伝子の ク ロ 一 二 ングに用 い ら れて い る各種のベ ク タ ー に 耝込む こ と に よ り 得 ら れる 。 こ の D N A塩基配列 の耝込みの た め に 好適な起源ベ ク タ ー の具体例 と し て は 、 上記 し た プラス ミ ド P B R 3 2 2 の他、 例 え ば以下の も の を例示で き る o プ ラ ス ミ ド P T U B 4 〔 バ チルス * ズプチ リ ス 由 来の ひ — ア ミ ラ ー ゼ の シ グナルペ プチ ド 、 H . Y amazak i et a I . , J . B acter i o I . , 1 5 6 , 3 2 7 - 3 3 7
    [0065] ( 1 9 8 3 〉 〕 、
    [0066] o プ ラス ミ ド P H C 5 〔 ェ シエ リ ヒ ア コ リ ー 由 来のマ ル 卜 ー ス結合蛋 白 の シ グナルペ プ チ ド 、 H . B edoue I I e et a I . , N ature , 2 8 5 , 7 8 - 8 1 ( 1 9 8 0 ) 〕 o プ ラス ミ ド P S N 5 1 8 〔 ェ シ エ リ ヒ ア コ リ ー 由 来 の リ ン 酸結合蛋 白 の シ グナルペ プ チ ド 、 K . agota et aに J . B acter i o I . , 1 5 7 , 9 0 9 - 9 1 7
    [0067] ( 1 9 8 4 〉 〕 、.
    [0068] o プ ラ ス ミ ド p J P 1 2 〔 ェ シ エ リ ヒ ア コ リ ー 由 来の リ ン酸制限下に誘導さ れる外膜蛋 白 の シグナルペプチ ド N . 0 verbeeke et a I . , J . o I . B iol , , 1 6 3 , 5 1 3 — 5 3 2 ( 1 9 8 3 ) 〕 等 。
    [0069] 上記起源ベ ク タ ー へ の シグナルペプチ ドを コ ー ドする D N A塩基配列 の導入操作は 、 従来よ り こ の種外来遺伝 子をベ ク タ ー に耝込む際に 用 い ら れて いる こ れ ら 操作に 従 う こ と がで きる 。 そ の例 は 、 前述 し た通 り で あ る 。
    [0070] ま た上記の ご と く し て得 ら れる本発明の シグナルぺプ チ ドを コ ー ド す る D N A塩基配列 を含むポ リ ペプチ ド分 泌発現用 ベ ク タ ー は 、 こ れを実際 に 宿主細胞 に導入 し て 目 的ポ リ ペプチ ド を分泌発現さ せ る た め に は、 こ れ に 目 旳ポ リ ペプチ ド を コ ー ド する D N A塩基配列 を さ ら に導 入 し なけ ればな ら ない こ と は勿論の こ と 、 他 に プロ モ ー タ ー 、 リ ボゾ ー ム結合部位 、 翻 訳停止シグナル 、 転写終 結因 子等の転写調節因子や翻 訳調節因子等を 含んで い な け ればな ら な い 。 こ れ ら の各因子 は 、 既に 起源ベ ク タ ー に 含 ま れて い る場合が あ り 、 こ の場合 に は該起源べ ク タ 一 、 例 えば P B R 3 2 2 由来の 3 ラ ク タ マ ーゼ の調節因 子等をそ の ま ま 用 い る こ と がで き る 。 こ れ に 限定 さ れる こ と な く 、 従来公知 の他の微生物又 は ウ ィ ルス 由 来の各 種 D N A も ま た 通常 こ れ ら の調節因子を含ん で お り 、 従 つ て こ れ ら を用 い る こ と もで きる 。 そ の例 と し て は 、 例 えば大腸菌 ラ ク 卜 ー ス 才 ペ ロ ン 、 卜 リ プ 卜 フ ァ ン オ ペ 口 ン 、 ス フ ァ ー ジの P L等のプ ロ モ ー タ ー 、 3 ガ ラ ク 卜 シ ダ ー ゼの S D配列等の リ ポゾ ー ム結合部位、 （ フ ァ ー ジ の t L 1 等の転写終結因子等を例示で き る 。 ま た 翻訳停 止シグナル と し て は 、 T A A、 T A G及び T G Aの 3通 り の塩基配列を利用 で きる 。 更 に 上記調節因子 は 、 し れ ら を含む D N Aよ り 常法 に従い 取 り 出 し た後、 必要な も の を適当 なベ ク タ ー に通常の方法 に 従い導入す る こ と も で き る 。
    [0071] 特 に 好 ま し い上記調節因子 と 、 シ グナルペプチ ド と を 保有す る本発明 ベ ク タ ー の一具体例 と し て は 、 P B R 3 2 2 を起源ベ ク タ ー と し て 構築さ れた p G H 5 4及び P G H 5 5 を例示で きる 。 こ れ ら のプ ラ ス ミ ドの 内 で p G H 5 4 は 、 （3 ラ ク タ マ ー ゼ のプ ロ モ ー タ ー 及び リ ボ ゾ ー ム結合部位 に 続い て 3 ラ ク タ マ 一 ゼ の シグナルぺプ チ ド を コ ー ド す る D N A塩基配列 を有 し 、 こ の塩基配列 の 3 ' 末端 に N ru l 及び P VII II の制 限酵素認識配列 を有 す る も ので あ る 。 そ の特性 は 、 その 製造概略操作 と共 に 第 1 図 に 示 し た 通 り で あ る
    [0072] 第 1 図 よ り 、 p G H 5 4 は図示さ れた 制 限酵素開裂地 図 に よ り 特徴付け ら れる 。 ま た 該 P G H 5 4 の大き さ は 1 . 0 %ァガ ロ ー スゲル電気泳動 に よ る測定の結果、 約 3 . 9 K b で あ る 。 こ のブラス ミ ド p G H 5 4 を保有す る大腸菌 H B 1 0 株は 、 通商産業省工業技術院微生物 工業技術研究所に 「 H B 1 0 1 〔 P G H 5 4 〕 」 な る 表示で 、 寄託さ れ て お り 、 そ の寄託番号 は微ェ研条寄第 6 7 9号 （ F E R M B P— 6 7 9 ) で あ る 。
    [0073] ま た P G H 5 5 は 、 3 ラ ク タ マ ーゼ のプ ロ モ ー タ ー 及 び リ ボゾー ム結合部位 に続い て /3 ラ ク タ マ ー ゼ の シダナ ルペプチ ド を コ ー ド する D N A塩基配列 を有 し て い る点 に お いて P G H 5 4 と共通する が 、 該 p G H 5 4 に おけ る第 2 の Ρ νιιϋ制 限サイ 卜 を含む約 0 . 6 4 kbの D N A を欠 く も のであ り 、 第 1 の P vu II制 限サイ 卜 を シ グナル ペプ チ ド を コ ー ド す る D N A塩基配列 の 3 ' 末端付近に 有 し て い る 。 そ の特性は 、 そ の製造概略操作 と共 に 第 2 図 に 示 し た 通 り で あ る 。
    [0074] 第 2図 よ り 、 p G H 5 5 は図示さ れた 制 限酵素開裂地 図 に よ り 特徴付け ら れ 、 そ の大き さ は 、 上記方法 に 従い 測定 し た結果、 約 3 . 3 k で あ る 。 こ のプラ ス ミ ド P G H 5 5 を保有 す る 大腸菌 株 は 、 通商産業 省工業技術院微生物 工業技術研究所 に 「 H B 1 0 . ( G H 5 5 ) 」 なる表示で寄託さ れて お り 、 その寄託 番号 は'微ェ研条寄第 6 8 0号 （ F E R M B P— 6 8 0 ) であ る 。
    [0075] 上記各種の調節因子を含み、 且つ シグナルペプチ ド を コ ー ド す る D N A塩基配列 と こ れ に 直接結合さ れた 目 的 ポ リ ペプチ ドを コ ー ドす る D N A塩基配列 と を有する本 発明 のポ リ ペプチ ド分泌発現ベ ク タ ー は 、 上記 し た本発 明ベ ク タ ー と同様に し て 構築さ れ、 本発明 はかかる成熟 ポ リ ペプ チ ド分泌発現ベ ク タ ー を も提供す る も ので あ る 本発明の こ の成熟ポ リ ペプチ ド分泌発現ベ ク タ ー に 、 シグ ナルペプ チ ド を コ ー ド す る D N A塩基配列 と連結さ れて 融合ポ リ ペプチ ド を コ ー ド す る D N A塩基配列 と し て保有さ れる ポ リ ペ プチ ド及びそ の D N A塩基配列 と し て は 、 任意の ポ リ ペプチ ド及びそ れを コ ー ド す る D N A 塩基配列 が いず れも利用 で きる 。 上記ポ リ ペ プチ ド の例 と し て は 、 例え ば表皮細胞増殖促進因子、 ソマ 卜 ス タ チ ン 、 イ ン シ ュ リ ン 、 G I P、 R — M S A 、 サイ モ シ ン β I 、 成長 ホルモ ン 、 成長ホルモ ン放出 因子等の ホルモ ン及び成長因子類 、 イ ン タ ー フ ェ ロ ン 、 イ ン タ ー ロ イ キ ン 2 、 腫瘍壊死因子等の リ ン フ 才 カ イ.ン免疫調節物質類 血清 アルブ ミ ン 、 プ ラ ス ミ ノ ー ゲ ン ァ ク テ ィ ベ ー タ 一、 アポ リ ポプ ロ テ イ ン等の血液構成物質、 B 型肝炎 ウ ィ ル ス表面抗原等の ワ ク チン用抗原蛋白質等を例示で き る 。 之等の各種ポ リ ペプチ ドを コ ー ド する D N A塩基配列 は そ れ ら の起源 と する細胞等か ら通常の方法に従い抽 出 単 離 し ても よ く 、 之等ポ リ ペプチ ド の ア ミ ノ 酸配列 に従い 化学合成す る こ と もできる 。
    [0076] 上記ポ リ ペプチ ド及び /又 はそ の D N A配列の具体例 を次に示す 。
    [0077] ◦ソマ卜スタチン
    [0078] A la G ly Cys Lys Asn Phe Phe
    [0079] 5'
    [0080] GTACGGACCAACATTCTTGAAGAAA
    [0081] Trp Lys T r Phe The Ser Cys oプロインシュリン
    [0082] Phe Val Asn Gin His Leu Cys G ly Ser His Leu
    [0083] Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg
    [0084] G ly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gin Val Giy Gin Val Glu Leu
    [0085] Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gin Pro
    [0086] Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin Lys Arg Gly l ie Val Glu Gin Cys Cys Thr Sep l ie Cys Sep
    [0087] Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
    [0088] (Nature , Vol. 282, 29, November 1979)
    [0089] oB型肝炎ウィルス表面抗原
    [0090] TCC 2 〇
    [0091] TCAATGTTAG
    [0092] oB型肝炎ウィルス表面抗原
    [0093] A
    [0094] o表皮細胞増殖因子 （ Epidermal Growth Factor )
    [0095] H - Asn-Ser-Tyr- Pro-G ly- Cys- Pro- Ser- Ser- Tyr-
    [0096] Asp-Gly-Tyr-Cys- Leu- Asn-Gly-Gly- Val-Cys-Met- His— I le- Glu- Ser- Leu- Asp-Ser-Tyr-Thr-Cys-Asn- Cys- Val- I le- Gly-Tyr- Ser- Gly-Asp-Arg- Cys- G I n- T r- Arg-Asp- Leu- Arg-Trp-Trp-G lu- Leu-Arg-OH
    [0097] ( C. R. Savage , J r . ， T. I nagam i , S. Cohen, J. Biol . C em . ， 247, 7612 ( 1972) ； C. R. Savage , Jr . , J. H. Hash , S. Cohen, J. Biol . Chem . , 248, 7669 ( 1973) )
    [0098] o G I P (Gastric I nhibitory Polypeptide) H-Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe- I le- Ser- Asp- Tyr- Ser- I le— Ala— Met— Asp— Lys- I le-Arg-G In-G In-Asp- Phe- Val - Asn- Trp- Leu- Leu- A la- G In-G In- Lys-Gly- Lys— Lys— Ser— Asp— Trp - Lys— His— Asn— I le-Thr-G ln- OH
    [0099] 〔 J . C. Brown, Can. J . B iochem. ， 4_9, 255 (1971 ) ； J C. Brown et al, 周上. ， 867 ( 1971〉 ； H. Yajima et al, J . Am . C em . Soc. , 7_, 5593 (1975) 〕 o成長ホルモン放出因子 （Growth Hormone- Releasing Factor )
    [0100] H- Val- H is- Leu- Ser- A la- Glu- Glu - Lys- Glu- A la- OH
    [0101] (A. V. Shally et al J. Biol . Chem . , 246, 6647 ( 1971 ) ； D. F. Veber et al, B iochem. B iophys. Res. Co画 n . , 45, 235 ( 1971 ) 〕 oソマ卜スタチン （Somatostatin )
    [0102] H— A la— Gly— Cys— Lys-Asn- Phe- Phe-Trp- Lys-T r- Phe 一 Thr— Ser— Cys— OH
    [0103] (A. V. Schally et al , Fed. Proc . Fed. Am . Soc. E p. Biol , . 34_, 584 ( 1975 ) 、 ' V. Schally et al, Biochemistry , V5_, 509 ( 1976) 〕 o R- S A (A Polypeptide with Multiplication -Stimulating Activity )
    [0104] H- Ala-Tyr-Arg- Pro-Ser-Glu-T r- Leu-Cys— Gly- G ly-G lu- Leu- Val - Asp- Thr- Leu- G In- Phe- Val - Cys- Ser- Asp- Arg-G ly- Plie—Tyr—Phe—Ser—Arg—Pro—Ser— G I y- Arg- A la- Asn- Arg- Arg-Ser- Arg- G ly- I le- Val - G lu- G lu- Cys - Cys- Phe- Arg- Ser- Cys- Asp- Leu-Ala- Leu- Leu-G lu - Thr- Tyr— Cys- A la- Thr- Pro- A la- Lys— Ser-Glu-OH
    [0105] 〔H. Marquart ， G. J. Todaro , J . Biol . Chem . , 256, 6859 ( 1981 ) 〕 っソマ卜スタチン一 28 (Somatostatin -28)
    [0106] H - Ser- A la- Asn- Ser- Asn- Pro- A I a- Met- A la- Pro- Arg-Glu-Arg- Lys— Ala— G I y— Cys— Lys— Asn— Phe- Phe- Trp- Lys-Thr- Phe- Thr-Ser- Cys- OH
    [0107] (F. Esch et al, Proc . Natl . Acad . Sci. U. S. A. ,
    [0108] 77, 6827 ( 1980) ； N. Ling et al, B iochem. B iophys. Res. Commun . , 9_5, 945 ( 1980) 〕 oサイモシン JSA (Thymosin β& )
    [0109] Ac -Ser- Asp- Lys- Pro- Asp- Met- A la- G I u- I le-Glu- Lys- Phe- Asp- Lys-Ser- Lys— Leu- Lys— Lys-Thr-Glu- T r-G In-G lu- Lys- Asn- Pro- Leu- Pro-Ser- Lys-G lu- Thr- I le- Glu- Gln-Glu- Lys- Gin- A la- Gly-Glu- Ser- OH
    [0110] 〔T. し K. Low et al , Proc . Natl . Acad . Sci.
    [0111] U. S. A. , 78., 1 162 ( 1981 ) 〕 上記ポ リ ペプチ ドの D N A塩基配列 と 、 シグナルぺプ チ ド の D N A塩基配列 と の連結 は 、 例 えば シ グナルぺ プ チ ド の D N A塩基配列 を保有 する本発明 の ポ リ ペプチ ド 分泌発現用 ベ ク タ ー に 、 上記ポ リ ペ プチ ド の D N A塩基 配列 を 、 前述 し た方法 に 従い 、 例 え ば制 限酵素を用 い る 酵素反応及び T A D N A リ ガ ー ゼ を用 いる 酵素反応を利 用 し て 導入する こ と に よ り 実施できる 。 ま た 、 予め 上記 ポ リ ペプチ ド と シ グ ナ ルペプチ ド と の融合ポ リ ペプ チ ド の D N A塩基配列を化学合成 し た後、 こ の D N A塩基配 列 を 、 前記 シ グ ナルペ プチ ドの D N A塩基配列 の導入 と 同様 に し て 、 ベ ク タ ー に導入する こ と に よつ て も 行な う こ と ができ る 。
    [0112] か く し て 融合ポ リ ペ プチ ドを コ ー ドする D M A塩基配 列を保有 する本発明 の ポ リ ペプチ ド分泌発現ベ ク タ ー を 得る こ と ができ る 。 こ れ は 、 上記融合ポ リ ペプチ ドを コ ー ド す る D N A 塩基配列 の 前 に プ ロ モ ー タ ー及ぴ リ ポゾ ー ム結合部位を有 し 、 且つ 上記塩基配列 を構成する 目 的 ポ リ ペ プ チ ド の D N A 塩基配列 の直後 に 翻 訳停止 シグナ ルを有 し て お り 、 適当 な宿主細胞 に導入 す る こ と に よ り 該細胞を形質転換 し て ポ リ ペプ チ ド 分泌発現型 と す る こ と がで き る 。
    [0113] 上記ポ リ ペプチ ド分泌発現ベ ク タ ー の好 ま し い一具体 例 と し て は p U G 2 0 1 を例示で き る 。 該 p U G 2 0 1 は 、 3 ラ ク タ マ ー ゼ のプ ロ モ ー タ ー 、 リ ポゾ ー ム結合部 位、 3 ラ ク タ マ ー ゼ の シ グナルペ プ チ ド の D N A塩基配 列 、 3 ゥ ロ ガ ス 卜 ロ ン （ 目 的ポ リ ペプチ ド ） の D N A塩 基配列及びそ の 翻訳停止シ グ ナルが正確 に こ の顆序で 配 列 さ れた D N A塩基配列を有 し て いる 。 その配列 は 、 後 記実施例 に おい て 第 4 表 と し て示 し た通 り であ る 。 該べ ク タ一 （ プラス ミ ド ） P U G 2 0 1 を保有する大腸菌 H B 1 0 1 株 は 、 通商産業省工業技術院微生物工業技術 研究所に Γ Η Β 1 0 1 ( P U G 2 0 ) 」 なる表示で寄 託さ れて お り 、 そ の寄託番号 は微ェ研条寄第 6 8 1 号 ( F E R M B P — 6 8 1 ) であ る 。
    [0114] 本発明 の ポ リ ペプ チ ド分泌発現ベ ク タ ー の宿主細胞へ の導入 は 、 公知の各種方法に従っ て 行な う こ と がで き 、 用 い ら れる宿主細胞 と し て も特に 限定 はな く 、 公知 の各 種のも ので よ い し の宿主細胞 と し て利用 さ れるも の と し て は 、 例 えば大腸菌等のグラ ム 陰性細菌、 枯草菌等の グラ ム 陽性細菌、 放線菌、 酵母等を例示で き る し れ ら の 内で特 に H B 1 0 1 株を初 め と す る 大腸菌 K 1 2 株由 来の 菌株は好ま し い 。 之等の宿主細胞 はいず れも菌体外 分泌成分 、 外膜構成成分等の 、 細胞の正常な據能維持 に 必要なポ リ ペプチ ド の分泌の た めの機構 と し て シ グナル ぺ プチダ ー ゼ を有 し て お り 、 ま た各種微生物 由来の シ グ ナルぺプチダ ーゼ の基質特異性 に は殆ん ど差のない こ と が知 ら れて い る （ D . P er I man and H . 〇 . H a I vo rs on, J . M ol . B iol . , 1 6 7 ， 3 9 1 ( 1 9 8 3 ) 〕 上記宿主細胞へ の導入方法の具体例 と し て は 、 例えば 宿主細胞を低温で塩化カ ルシ ウ ム を含む水溶液中で処理 し 、 該溶液中 に ベ ク タ ー を添加 する方法 〔 E .
    [0115] L ederberg , S . C ohen, J . B acter i o I . , 1 1 9 , 1 0 7 2 ( 1 9 7 4 〉 〕 を例示で き る 。
    [0116] 上記の よ う に し て 本発明ベ ク タ ー を導入 し て形質転換 し た細胞を培養す る と き に は 、 細胞内で融合ポ リ ぺ プチ ド が生産さ れ、 続い て細胞外又 はペ リ ブ ラズム に成熟ポ リ ペプチ ド が分泌蓄積さ れる 。 即 ち 、 ま ず 、 ベ ク タ 一 中 の融 合ポ リ ペプチ ドを コ ー ドす る遺伝子か ら 、 ベ ク タ ー 中 の転写調節因子並び に 宿主細胞中の諸因子の作用 で m R N A が生産さ れる 。 次いで 、 m R N A か ら 翻訳調節 因 子並び に 宿主細胞中'の 諸々 因子の作用 で融合ポ リ ぺ プ チ ド が生産 さ れる 。 更 に こ こ で生産さ れる融合ポ リ ぺプ チ ド は 、 シ グ ナルペプチ ド の作用 に よ り 、 細胞外又 は ぺ リ ブラズム に 分泌 さ れ 、 同 時に シグナルぺプチダーゼ の 作用 に よ り 、 融合ポ リ ペプ チ ド か ら シ グ ナルペプチ ド が 切 り 離さ れる ので あ る 。 そ の結果、 シグナルペ プチ ドも ま た 他の如 何な る不要な ア ミ ノ 酸配列 を も 含 ま な い成熟 ポ リ ペプチ ド が細 胞外又 はペ リ ブ ラズ ム に 分泌 、 蓄積さ れる 。 か く し て分泌、 蓄積さ れた成熟ポ リ ペプチ ド は 、 こ れ を常法に従い分離す る こ と がで き 、 ま た更に精製す る こ と ができる 。 こ の分離、 精製操作 と し て は例 えば培養上 澄又は浸透圧シ ョ ッ ク 法 に よ り 調整 し た ペ リ プラズム画 分か ら 、 ゲル泸過 、 吸着ク ロ マ ト グラ フ ィ ー 、 イ オ ン交 換ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー 、 高速液体ク ロ マ ト グラ フ ィ ー 等 を適宜組合せた方法を採用 する こ と がで き る 。 特に本発 明 に従い得 ら れる 目 的ポ リ ペ プチ ド は 、 分泌さ れた も の であ る た め 、 そ の分離、 精製が比較的容易で ある利点が ある 。
    [0117] 発明を実施する た め の最良の形態
    [0118] 以下、 本発明 を更 に 詳 し く 説明 す る た め実施例 を挙げ る 。 尚 、 各例 に お いて 用 い ら れて い る各方法及び操作は 、 特に 明記 し な い 限 り 、 以下の通 り 行なわ れた も ので あ る 。 1 . 制 限酵素 に よ る D N A の切 断操作
    [0119] D N A の水溶液 （ 又は緩衝液溶液 ） 或い は粉末 に 、 下 記第 1 表 に示 し た 各緩衝液の濃縮液及び水を混和 し 、 次 いで制 限酵素を加 え 、 3 7 °C の水浴中で 3 時間静 置 し て 反応さ せ る 。 制 限酵素の標準的使用 量 は、 D N A 1 g に対 し て 1 ユ ニッ ト で あ り 、 最終液量 は 1 0 ^ 2 と な る よ う に す る 。 第 Ί 表
    [0120] 耝 成 低塩濃度 中塩濂度 髙塩濃度
    [0121] ( ni ) 緩衝液 緩衝液 緩衝液 塩化ナ 卜 リ ウ ム 0 5 0 1 0 0 卜 リ ス塩酸
    [0122] ( H 7 . 5 ) 1 0 0 5 0 塩化マグネ シ ウ ム 0 〇 1 0 ジ チ 才 ス レ イ ト ール
    [0123] 2 . フ エ ノ ー ル抽 出法
    [0124] 酵素反応の終了後 、 酵素を失活さ せ反応を停止さ せる た め に こ の抽 出法を行な っ た 。 即 ち 、 反応液に 、 そ の 液 量の半量 と な る T E飽和 フ エ ノ ー ル （ 1 m D T A を含む 1 O m M 卜 リ ス塩酸 （ P H 8 . 0 ) 緩衝液を フ エ ノ ー ル に 飽和 さ せ た も の ） を加 え て充分混和 し た 後 、 周 じ く 半量の ク ロ 口 ホルム を加 え て 更 に 混和 し 、 次い で遠 心分離 し て D N Aの 含 ま れる緩衝液層を取る 。 更 に 0 . 1 倍量の 3 M酢酸ナ ト リ ウ ム緩衝液 （ P H 5 . 0 ) と 2倍量の冷エ タ ノ ール と を加 え て 混和 し て 、 一 2 0 で 1 時間 以上放置 し て D N Aを 沈殺 と し て 回収す る こ と に よ り フ エ ノ ー ルを 完全 に 除去 す る 。 3 . D N Aポ リ メ ラ ーゼ I ( ク レ ノ ー 断片 ） に よ る D N Aのプラ ン 卜 エ ン ド化方法
    [0125] 4 0 m M リ ン酸カ リ ウム （ P H 7 . 4 ) 、 6 m M塩化 マ グネ シ ウ ム 、 1 m M 3 —メ ルカ プ 卜 エ タ ノ ー ル、 1 m A T P及び各 1 m Mの d A T P、 d C T P、 d G T P及び d T T Pを 含む水溶液中 に 、 D N Aを溶か し 、 D N A I ^ g に対 し て 1 ユニッ ト と な る量の D N A ポ リ メ ラ ー ゼ I ( ク レ ノ ー 断片、 宝酒造㈱製 ） を加 え 、 1 2でで 3 0分間反応さ せ る 。
    [0126] 4 . 丁 4 0 八 リ ガ ーゼ に ょ る 0 八 断片の結合 （ 環状 化 ） 操作
    [0127] 6 6 m M 卜 リ ス塩酸 （ P H 7 . 5 ) 、 6 . 6 m M塩化 マグネ シ ウ ム 、 1 0 m Mジ チ 才 ス レ イ 卜 ー ル及び 1 m A T Pに 0 . 0 1 % の牛血清アルブ ミ ン を添加 し た水溶 液中で 、 D N A断片 と 、 そ の Ί g 当 り 3 ユ ニ ッ ト と な る量の T 4 D N A リ ガ ーゼ （ 宝酒造㈱製 ） と を 、 1 2 °C で 5 時間以上反応さ せ る こ と に よ り D N Aを結合 （ 環状 化 ） さ せる 。
    [0128] 5 . 形質転換方法
    [0129] 宿主細胞 と し て は 、 大腸菌 K 1 2株由 来の H B 1 0 1 株を用 い る 。 H B 1 0 1 株を 、 L B培地 （ Ί %パ ク 卜 卜 リ プ ト ン 、 0 . 5 %パ ク 卜 ィ ー ス 卜 エ キ ス 、 0 . 5 %塩化ナ 卜 リ ウ ム ） で 、 3 7 °C下 、 6 1 0 nmの吸光度が 0 . 2 5 に なる ま で増殖さ せ 、 培養液 4 0 πιδを遠心分離 （ 6 0 0 0回 転 Ζ分 X 1 0分 ） し て 菌体を 回収 し 、 次いで氷冷 す る 。 れを 0 . 1 Μ塩化マ グネ シ ウ ム 2 0 mfiで洗净 し 、 続い て 氷冷 し た 0 . Ί iVI塩化カ ルシ ウ ム及び 0 . 0 5 M塩化マ グネ シ ゥ ム 溶液 2 0 πιβに懸濁 さ せ 、 1 時間氷冷す る 。 遠 心分離 （ 6 0 0 0回転 Ζ分 X Ί 0分 ） 後 、 菌体を氷冷 し た 0 . 1 Μ塩化 カ ル シ ウ ム及び 0 . 0 5 Μ塩化マグネ シ ゥ ム 溶液 2 ιπβに再懸濁 させ る <_ の 懸濁液 0 . 212 に 、
    [0130] T i D N A リ ガ ー ゼ を用 い て 結合 さ せ た D N A断片の反 応組成液 0 . 0 1 mfiを加 え 、 Ί 時間 氷冷する 。 次いで 4 2 . 5 Cの 水浴で 9 0秒間加 温 し 、 L B培地 2 . 8 in3 を加 え 、 こ れを 3 7 'Όの水浴中で 1 時間 静置する 。
    [0131] 次 に 、 得 ら れる形質転換株 を以下の 抗生物質耐性で選 択 す る 。 即 ち 、 Ί . 5 %寒天 を含む L Β培地 に ア ン ピ シ リ ン 5 0 , g / ιπδ又 は テ 卜 ラ サイ ク リ ン 2 0 ^ g Z maを 添加 し て 調整 し た 平板培地 に 、 上記で得 た 反応耝成液の 溶液各 0 . 3 mSずつ を 拡げ 、 こ れを 3 7 で一晩培養 し 生 育す る大陽菌 コ ロ ニ ー を分離す る 6 . プラ ス ミ ドの単離
    [0132] プラス ミ ドを保有する菌株を 、 ア ン ピ シ リ ン 5 0 〃 g Ζ ιπδ又 は テ 卜 ラ サイ ク リ ン 2 0 ^ g / πιδを添加 し た し B 培地 5 0 0 msで 、 6 1 0 nmで の吸光度が約 0 . 6 に な る ま で 3 7でで振盪培養す る 。 次いで ク ロ ラ ム フ エ ニ コ ー ル 8 0 mgを加 え 、 3 7 °Cで 1 2〜 1 6時間振盪培養する 。 こ れを遠心分離 （ 6 0 0 0回転 /分 X 1 0分 ） し て 菌体 を集め 、 0 . 8 5 %塩化ナ ト リ ウ ム水溶液で洗浄する 。 菌体を 2 096蔗糖及び 5 0 m M 卜 リ ス 塩酸 （ P H 8 . 0 ) 溶液 2 . 5 ιδに 懸濁させ 、 次 に 1 % リ ゾチー ム を 含む 0 . 2 5 Μ 卜 リ ス塩酸 （ Ρ Η 8 . 0 ) 溶液 0 . 5 13を加 え 、 分間水冷する 。 更 に 0 . 2 5 M E D T A
    [0133] ( Η 8 . 0 ) 1 ιπδを加 え 、 Ί 0分'間氷冷 す る 。 次に 6 m Μ 卜 リ ス塩酸 （ Ρ Η 8 . 0 ) 、 6 0 m M E D T A及 ぴ 0 . 1 % 卜 リ 卜 ン X— 1 0 0 の溶液 4 mfiを加 える 。 こ れを超遠心 （ 2 5 0 0 0回転 /分 X 9 0 分 ） し て上清を 採取す る 。 こ の上清 8 . 2 msに 塩化 セ シ ウ ム 9 . 0 g を 加 え て 溶か し 、 次いで Ί % ェチジ ゥ ムブ ロ マ イ ド 溶液 0 . 8 ι3を加 え る 。 こ れを遠心分離 （ 2 0 0 0回転 ./分 X 1 0 分 ） し て 浮遊物を 除き 、 溶液を超遠心
    [0134] ( 5 0 0 0 0回転 . Z分 X 1 5 時間 ） する 。 次いで紫外線 照射 に よ り 螢光を発するプラ ス ミ ド部分を分離す る 。 こ れを 5 M塩化 ナ ト リ ウ ム溶液で飽和 し た イ ソ プ ロ パ ノ ー ルで 5 〜 &回抽出 し て.こ れか ら ェ チジ ゥ ムプ ロ マ イ ド を 除去 す る 。 最後 に 1 0 m M 卜 リ ス塩酸 （ P H 8 . 0 ) 及 び Ί ϋΐ Μ E D T A に対 し て透析 し て 塩化セ シ ウ ム を 除 去す る 。
    [0135] 7 . 才 リ ゴヌ ク レ オ チ ドの合成
    [0136] 才 リ ゴヌ ク レ オ チ ド の合成 は 、 下記 に示す 固相合成法
    [0137] ( 固相 リ ン酸 卜 リ エ ス テル法 ） に よ り 行なっ た （ Η . I to e t a I , N ec I e i c A cids R esearch, 0 ,
    [0138] 1, 7 5 5 - 1 7 6 9 ( 1 9 8 2 ) 〕 。
    [0139] 即 ち 、 ま ず 1 %架橋ポ リ ス チ レ ン樹脂 S — X Ί
    [0140] ( 2 0 0 〜 4 0 0 メ ッ シ ュ 、 パ イ オ ラ ド ラ ボ ラ 卜 リ ー ズ 社製 ） を ァ ミ ノ メ チル化 し た も の と 、 5 ' — 0 — ジ メ 卜 キ シ 卜 リ チルヌ ク レ オ シ ド の モ ノ コ ハ ク 酸エ ス テル と を 反応 さ せ て 、 ヌ ク レ オ シ ド担持樹脂を得る 。 次 に 、 バ ー チ ェ ム社製 D N A合成機を用 い て 以下の操作を行な う 。
    [0141] 上記樹脂 4 O mgを反応管 に 入れ 、 Ί Μ臭化亜鉛のジ ク 口 口 メ タ ン 一 イ ソ プ ロ パ ノ ー ル （ 8 5 ： 1 5 ) 溶液を 用 い て 5 ' 位の ジ メ 卜 キ シ 卜 リ チル基を脱離さ せ る 。 次 に 完全 に 保護 さ た ジ ヌ ク レ オ チ ド （ C . B roka et a I N ucleic A cids R esearch, 8 , 5 4 6 1 - 5 4 7 1 ( 9 8 0 ) の方法 に よ り 調製 し た 〕 の 卜 リ エ チルアン モ ニ ゥ ム塩 5 0 mgを加え 、 縮合剤 （ メ シ チ レ ン スルホ 二 ル ー 5 — 二 卜 口 卜 リ アゾー ル ） を用 い て縮合させる 。 以 上の操作を繰返 し て 、 頫次鎖長をのば し て 、 保護さ れた 才 リ ゴヌ ク レ オ チ ドを担持 し た樹脂を得る 。 尚 、 最後の 縮合工程で は 、 必要に応 じ て ジヌ ク レ オチ ド の代 り に 、 前記文献に記載の方法に よ り 調製さ れる モ ノ ヌ ク レ オ チ ド の 卜 リ エ チル ア ン モ ニ ゥ ム塩 2 5 mgを使用 す る 。
    [0142] 次 に 0 . 5 M ピ リ ジ ン 力 ル ドキ シ メ 一 卜 の ピ リ ジ ン 一 水 （ 1 ： 1 ) 溶液を用 い て 、 保護さ れた オ リ ゴヌ ク レ オ チ ド を樹脂か ら脱離させる 。 こ れを セ フ アデッ ク ス G— 5 0 カ ラ ム （ フ アルマ シ ア社製、 2 X 1 0 0 cm ) で 、 更 に 高速液体 ク ロ マ ト グラ フ ィ ー （ ポ ンプ ： ウ ォ ー タ ー ズ 社製 6 0 0 0 A型、 検出 器 ； 4 4 0型ディ テ ク タ ー 、 力 ラ ム ； マ イ ク ロ ポ ンダ ーパ ッ ク C 1 8 、 溶出溶媒 ； （ 5 → 4 0 % ) ァセ 卜 二 卜 リ ル 一 0 . 酢酸 卜 リ エ チル ァ ンモ ニ ゥ ム水溶液 ） で精製 する 。 次に 8 0 %齚酸 に よ り 脱保護反応 を行な い 、 再度高速液体ク ロ マ 卜 グラ フ ィ ー に よ り 単一 ピ ー ク に なる ま で精製 する 。 こ の高速液体 ク ロ マ 卜 グ ラ フ ィ 一 の条件 は 、 溶出 溶媒 と し て （ 5 → 2 5 % ) ァ セ 卜 二 卜 リ ル — 0 . Ί Μ酢酸 卜 リ エチル ア ン モニ ゥ ム水溶液を用 い る以外は 、 上記 と同一 と す る 。 · 8 . D N A塩基配列の分析
    [0143] D N A塩基配列 の分析は 、 メ シ ン グ （ M essi ng ) の方 法 〔 Μ Ί 3 法、 M ethods E nzymol . , 1 0 1 , 2 〇
    [0144] ( 1 9 8 3 ) 〕 に 従い 、 以下の よ う に行なっ た 。 即 ち 、 ま ず D N A 断片を制限酵素に よ り 切 り 出 し 、 1 % ァガ ロ ー スゲル電気泳動 に よ り 分離する 。 こ の D N A 断片を 1 3 tnp8 R F ( アマ 一 シ ャ ム社製 ） を ベ ク タ ー と し て ク ロ ー ニ ングする 。 得 ら れる耝換え フ ァ ー ジ D N A をマ ン デル （ M andei ) と ヒ ガ （ H iga ) の方法 〔 J . ol B iol . , 5 3 , 1 5 4 ( 1 9 7 0 ) 〕 に よ り 、 大腸菌 J M 1 0 7 株へ形質導入する 。 こ の 菌体懸濁液 0 . 2 mfi に 、 S S mgZ nifiの イ ソ プ ロ ピル 一 3 — D — チ才 ガ ラ ク 卜 シ ド 2 5 ^ S 及び 2 0 mgZ iii5の 5 — ブ ロ モ ー 4 — ク ロ 口 一 3 — イ ン ド リ ル 一 iS — D — ガ ラ ク 卜 シ ド 4 0 2 を加 え た 。 次いで こ の菌体懸濁 液を加熱溶解さ せ た 後 、 5 0 で保温 し た H — 卜 ッ プ アガ 一 液 （ Ί %パ ク 卜 卜 リ プ 卜 ン 、 0 . 8 %塩化ナ ト リ ウ ム及び 0 . 5 %寒天 ） 3 πιδを 加 え 、 1 . 5 %寒天を加 え て 固化さ せ た 2 Χ Τ Υ 培地 ( 1 . 6 %パ ク 卜 卜 リ ブ 卜 ン 、 1 %酵母エキス 及び 0 . 5 %塩化ナ ト リ ウ ム ） の平板 に重層 し 、 3 7 で一 晚培養する 。 D N A断片の挿入さ れた耝換え フ ァ ー ジ は 無色のプラ ー ク を生 じ るの に対 し 、 親株の M 1 3 mp8 は 青色のプラ ー ク を生 じ る ので 、 目 的の耝換え フ ァ ー ジ は 容易 に選別でき る 。
    [0145] 次に 単一の無色プラ ー ク をパ ス ツ ール ピ ぺッ 卜 に て取 り 出 し 、 こ れ と J M 1 0 3株の培養液 0 . 0 1 と を 、 2 Χ Τ Υ培地 1 in8に加 え 、 約 5 時間 、 3 7 Χίで振盪培養 し て 耝換え フ ァ ー ジ を増殖さ せ 、 培養後、 遠心 に て菌体 を 除き 、 上清に 2 0 %ポ リ エチ レ ング リ コ ール 6 0 0 0 の 0 . 2 πώを混合 し 、 室温で 1 5 分以上静置 し た後、 遠 心 に て沈濺する フ ァ ー ジ を集め 、 フ エ ノ ール抽 出 に よ つ て 、 フ ァ ー ジ か ら 一本鎖 D N Aを抽 出 し 、 こ れを铸型一 本鎖 D Ν Α と し て 用 いる 。
    [0146] 錶型一本鎖 D N Aプ ラ イ マ ー （ 宝 酒造㈱製 、 M 1 3 の 1 5塩基プライ マ ー ） と のそれぞれ 0 . 5 P mo I ずつ を 混合 し 、 6 0 °Cで 2 0分間熱処理後 、 徐冷す る 。 。 次 に こ の混合液に α 3 2 Ρ - d C T P ( アマ シ ャ ム社製、 4 0 0 C i / m mo I ) 2 ^ S と D N Aポ リ メ ラ ー ゼ I ( ク レ ノ ー 、 宝酒造㈱製 ） 2 ユ ニ ッ ト と を加 え 、 充分に 混合 し た後 、 そ の 3 . 2 , " 2 ずつ を 、 下記第 2 表 に示 し た 4種の（I N T P— ddN T P混合液のそれぞれ を 含む反応管 に加 える 。 室温で 2 0分間反応さ せ た後、 チ エ ー ス反応液 （ d A T P、 d C T P、 d G T P及び d T T Pの各 1 m ) の をそ れぞれ に加 え 、 更 に 2 0分間反応さ せる 。 ホルム ア ミ ド停止液 （ 9 5 % v / ホル ム ア ミ ド 、 0 . 1 % キ シ レ ン シ ァ ノ ー ル及び 0 . 1 %ブ ロ ム フ エ ノ ールブルー ） を ずつ加え 、 9 5 eCで 3分間加熱 し た 後、 急冷す る 。 次に サ ンプル 2 2 ずつ を 、 6 %又は 8 % ポ リ ア ク リ ルア ミ ドゲル に よ り 電気泳動 （ 1 8 0 0 、 3 0 111 八 、 2〜 3 時間 ） さ せ る 。 泳動後 、 ゲルを 紙 （ ヮ ッ 卜 マ ン 3 M M ) に移 し 、 ゲル乾燥器 に て 乾燥 し 、 ォ ー 卜 ラ ジ オ グラ ム を と り 、
    [0147] D N A塩基配列を解読する 。
    [0148] 第 2 表 d N TP— ddNTP混合液钽成 、 A )
    [0149]
    [0150] 但 し 第 2 表中 、 d d A は ジデ才 キ シ アデ ノ シ ン を 、 fl ( C は ジ デ 才 キ シ シ チ ジ ンを 、 d d G は ジデ 才 シ グ ア ノ シ ン を 、 ま た d d T は ジデ才キ シ チ ミ ジ ン をそれぞれ示す 。 9 . ァ ガ ロ ー ス ゲル電気泳動
    [0151] シ ュ ラ イ フ （ S Ghlei f ) と ウ ェ ン シ ン ク （ W ensi nk ) の手引 書 （ " P ractical M ethods i n M olecu lar B iology" ( 1 9 8 ) , S pr i nger - V e r I a g 社 、 p p 1 1 4 - 1 2 5 〕 に 記載の方法に 従っ て 、 ァ ガ ロ ー スゲ ル電気泳動及び泳動後のゲルか ら の D M A断片の分離を 行な う 。 泳動用電源 と し て は 、 ァ 卜 一社製 コ ン ス タ ー パ ヮ ー S J 1 0 6 5型を 、 泳動槽 と し て は 1 2 x 1 5 cmの プラ ス チッ ク 製水槽 （ 白金電極付 ） を 、 ァ ガ ロ ー ス と し て は ァガ ロ ー ス I ( 周仁化学研究所製 ） を、 ま た泳動用 緩衝液 と し て は 4 0 m M 卜 リ ス塩酸 （ 5 m M酢酸 ナ 卜 リ ゥ ム及び 1 m D T A含有、 P H 7 . 9 ) をそ れぞ れ用 い る 。
    [0152] 1 0 . ポ リ ア ク リ ル ア ミ ドゲル電気泳動
    [0153] 上記手引 書の第 7 8 — 8 7 頁及び第 1 1 4 一 1 2 5 頁 に 記載の方法 に 従い 、 ポ リ ア ク リ ル ア ミ ドゲル電気泳動 及び泳動後のゲルか ら の D N A断片の分離を行な う 。 泳 動用 電源 と し て は 、 ァ 卜 一 社製 コ ン ス タ ー パ ワ ー S J 1 0 6 5 型を 、 泳動槽 と し て は ァ 卜 一社製 S J 1 0 6 0 S D型を用 い る 。 ア ク リ ルア ミ ド溶液 と し て 、 ア ク リ ル ア ミ ド と N ， N ' ー メ チ レ ン ビ ス ア ク リ ル ア ミ ド （ 2 9 対 1 〉 と の水溶液を 、 重合促進剤 と し て N , N , N ' ,
    [0154] N ' ー テ 卜 ラ メ チ レ ン エ チ レ ン ジ ァ ミ ン を 、 合触媒 と し て 過硫酸 ア ン モ ニ ゥ 厶 をそ れぞれ用 い る 。 ま た 泳動用 緩衝液 と し て 9 0 m M 卜 リ ス塩酸 〈 9 0 m M湖酸 、 2 . 5 m M D T A含有、 ！） H 8 . 3 ) を用 い る 実施例 1
    [0155] 成熟ポ リ ペプチ ド分泌発現用 ベ ク タ ー P G H 5 4及び P G H 5 5の構築
    [0156] ( A ) 中 間体プラス ミ ド P G H 5 3 の構築
    [0157] ① 大腸菌の 3 — ラ ク タ マ ーゼ の シグナルペプチ ドの一 部を コ ー ド する D N A塩基配列を有する オ リ ゴヌ ク レオ チ ドの合成の た め に 、 以下の塩基配列を有する 4種の 才 リ ゴヌ ク レ オチ ドのそ れぞれを 、 前記 し た 固相 リ ン酸 卜 リ エ ス テル法 に よ り 合成 し た 。
    [0158] < > 5' C G C C G G C C T T T T G C C T T C C
    [0159] T G T C - 3'
    [0160] T
    [0161] 上記 才 リ ゴヌ ク レ オ チ ド 〈 2 〉 及び 〈 4 〉 の 5 ' 端を それぞれ T i ポ リ ヌ ク レ オ チジル キ ナ ー ゼ （ B R L社製 ） を 用 い て リ ン酸化 し た 。 即 ち 、 各々 1 〇 g の オ リ ゴヌ ク レ オ チ ド を 5 0 m M 卜 リ ス塩酸水溶液 （ Ί 0 m M塩化 マ グネ シ ウ ム 、 5 iii iV1ジ チ才ス レ イ 卜 ール 、 1 m M A T Pを含む、 p H 9 . 5 ) 5 0 〃 S に 溶か し 、 こ れ に T 4. ポ リ ヌ ク レ オ チジルキ ナ ー ゼ 5 ユニッ ト を加 え 、 3 7で で 3 0分間反応さ せ 、 フ エ ノ ー ル抽出 に よ り 反応 を停止 さ せ た 。
    [0162] ② ク ロ ー ニ ングベ ク タ ー と し て 、 プラ ス ミ ド P B R 3 2 2 ( B ol ivar et a I , G ene , 2 , 9 5 - 1 3 ( 1 9 7 7 ) 〕 を利用 し た 。
    [0163] 該プラス ミ ド P B R 3 2 2の Ί 0 g を 、 制 限酵素 P st l ( 宝酒造㈱製 ） と P vu l ( N E B社製 ） と を用 い て 髙塩濂度緩衝液中で切 断 し 、 Ί . 0 %ァ ガ ロ ー スゲル 電気泳動 を行ない 、 約 4 . 2 4 kbの D N A断片を分離 し た 。
    [0164] ③ 上記②で得た D N A断片を 、 上記①で調製さ れた リ ン 酸化 し た オ リ ゴヌ ク レ オ チ ド 〈 2 〉 及び 〈 4 〉 並び に リ ン酸化 し て いない 才 リ ゴヌ ク レ オ チ ド < Ί 〉 及び 〈 3 〉 のそ れぞれ約 ずっ と 合せ て 、 D N A リ ガ ー ゼ で結合反応さ せ た 。 反応終了後 、 こ の反応組成液で大腸 菌 K 一 1 2株由 来の Η Β Ί 0 1 株を形質転換さ せ た 。 得 ら れた テ 卜 ラサイ ク リ ン耐性を示す形質転換株の 中か ら 1 株を 選び 、 こ れか ら プ ラ ス ミ ド を 単離 し 、 目 的 と す る P G H 5 3 を得 た 。 一連の操作の概略 は第 1 図 に示す通 り で あ る 。
    [0165] 第 1 図 は起源ベ ク タ ー P B R 3 2 2 に合成オ リ ゴヌ ク レ オ チ ド 〈 1〉 、 < 2 > , 〈 3 〉 及び 〈 4 〉 を ク ロ ー 二 ン グ し て プ ラ ス ミ ド P G H 5 3を得る 工程及びこ れ に よ り 得 ら れる p G H 3の特徴を示す図で あ り 、 図中 ロ は 合成 才 リ ゴヌ ク レ オ チ ド由来の塩基配列 を示 し て い る 。
    [0166] 得 ら れた P G H 5 3 は 、 1 . 0 %ァ ガ ロ ースゲル電気 泳動 の結果、 4 . 3 K b の大き さ を有 し て お り 、 そ の D N A塩基配列 を Μ Ί 3法 に よ り 分析 し た結果 、 P B R 3 2 2の P stl及び P vul の両制 限サイ 卜 間 が欠失 し 、 代 り に 次 に示す よ う に 、 才 リ ゴヌ ク レ オ チ ド 〈 1 〉 、 〈 2 〉 、 〈 3 〉 及び 〈 4 〉 が挿入さ れて い る こ と が確認 さ れた 。
    [0167]
    [0168] < 2 >
    [0169] GAACTCAGCTGCAlG
    [0170] CTTGAGTCG CGTC
    [0171] Pstl制限サイ卜 該 P G H 5 3 は 、 通商産業省工業技術院微生物 工業技 術研究所に Γ Η Β 1 0 1 ( G H 5 3 ) 」 なる表示で微 ェ研条寄第 6 7 8号 （ R B P— 6 7 8 ) と し て 寄託さ れて い る 。
    [0172] ( B ) 成熟ポ リ ペプチ ド分泌発現用 ベ ク タ ー P G H
    [0173] 5 4 の構築
    [0174] ① 上記 （ A ) で得た P G H 5 3 の 1 0 9 を制 眼酵素 N ael ( N E B社製 ） 及び A val ( 宝酒造㈱製 ） を用 い て 中塩濂度緩衝液中で切 断 し 、 次いで 1 . 0 %ァ ガ ロ ー スゲル電気泳動 を行なっ て 、 約 2 . 2 2 kbの D N A断片 《 A》 を分離 し た 。
    [0175] し の 断片 は 、 合成オ リ ゴヌ ク レ オ チ ド 由 来の D M A配 列 の大部分 と プ ラ ス ミ ド の 複製開始領域を含ん で い る 。
    [0176] ② P B R 3 2 2 を制 限酵素 A val 及び H ind ffl ( いず れ も宝酒造㈱製 ） で 、 中塩濃度緩衝液を用 い て 切 断 し 、
    [0177] 1 . 0 % ァ ガ ロ ー スゲル電気泳動を行なっ て 、 約 1 . 4 〇 kbの D N A断片 《 B 》 を得 た 。
    [0178] こ の 断片 に は 、 テ 卜 ラ サイ ク リ ン耐性遺伝子のプ ロ モ 一タ ー の一 部 と テ 卜 ラ サイ ク リ ン耐性の 構造遺伝子 の 全 て が 含ま れて いる 。
    [0179] ③ P B R 3 2 2 の 2 0 g を制 限酵素 F nu4 H I ( N E B社製 ） で低塩濃度緩衝液を用 い て切断 し 、 次い で S 1 ヌ ク レ ア ーゼ に よ り D N A断片末端の突出塩基を 分解除去 し た 。 こ れ は フ エ ノ ール抽出後の D N Aを 、 6 m M酔酸ナ ト リ ウ ム 、 4 0 m M塩化ナ 卜 リ ウ ム及び 1 m M硫酸亜鉛緩衝液 （ P H 4 . 5 ) 1 mSに 溶か し 、 こ れ に 2 0 0 0 ユニッ ト の S 1 ヌ ク レ ア ー ゼ （ B R L社製 ） を加 え て 2 0 で 3 0分間反応させ る こ と に よ り 行なつ た 。 次いで 、 フ エ ノ ール抽出後の 、 D N Aを制 眼酵素 H ind IEで 中塩寢度緩衝液を用 い て 切 断 し 、 6 %ポ リ ア ク リ ル ア ミ ドゲル電気泳動 を行な い 、 約 0 . 2 8 kbの D N A断片 《 C》 を得た 。
    [0180] こ の断片に は 、 3 — ラ ク タ マ ーゼ のプ ロ モ ー タ ー 、 リ ボゾ ー ム結合部位、 シグナルペプチ ド を コ ー ド する遺伝 子の一部の他 、 テ 卜 ラサイ ク リ ン耐性遺伝子の プ ロ モ ー タ ー の一部が含 ま れて い る 。
    [0181] ④ 上記で得た 3 つ の 断片 《 八 》 、 《 B 》 及び 《 C》 を 、 T 4 D N A リ ガ ーゼを用 い て結合させた 。 反応後 、 こ の 反応組成液で H B 1 0 1 株を形質転換 し た 。 得 ら れ fcテ 卜 ラ サイ ク リ ン耐性を示す形質転換株の 中 か ら 1 株を選 びプ ラ ス ミ ド を 単錐 し た 。 かく し て p G H 5 4 を得た 。
    [0182] P G H 5 4 は 、 Μ Ί 3 法 に よ る塩基配列分析の結果、 β ラ ク タ マ ー ゼ の プ ロ モ ー タ ー及び リ ボゾー ム結合部位 に続いて シグ ナルペプ チ ド を コ ー ド す る D N A塩基配列 を有 し 、 こ の塩基配列 の 3 ' 末端の上流側 に N rul及び 下流側 に P vu の そ れぞれの制 限酵素認識配列 を有 し て い る こ と が確認さ れた 。
    [0183] —連の操作の概略 は 、 第 2図 に示さ れる通 り で あ る 。 第 2図 は！） G H 5 3 と P B R 3 2 2 と か ら本発明 ポ リ ペ プチ ド分泌発現用 ベ ク タ ー P G H 5 4を得る 工程及び 得 ら れた ベ ク タ ー P G H 5 4の特性を示す 図で あ り 、 図 中 顬 は シ グ ナ ル ペ プ チ ド を コ ー ド す る塩基配列を示す 。
    [0184] P G H 5 4 は 、 前記 し た 通 り 約 3 . 9 K b の大き さ 及 び第 2 図 に示す制 限酵素開裂地 図 に よ り 特徴付け ら れ 、 ま た VI 1 3法 に よ る塩基配列分析の結果 、 前記式 （ 3 ) に 示 し た 塩基配列 に よ り コ ー ド さ れる 3 ラ ク タ マ ー ゼ シ グ ナ ^ペプチ ド の遺伝子を有 す る こ と が確認 さ れた 。 ( C ) 成熟ポ リ ペ プチ ド分泌発現用 ベ ク タ ー P G H
    [0185] 5 5 の構築
    [0186] ΐ P B R 3 2 2の A V a I 及び Ρ V u I制 限サ イ 卜 間 の塩 基配列 を欠失 さ せ た プラ ス ミ ドで あ る P B R H 0 2 を次 の操作 に よ り 作成 し た 。 即 ち P B R 3 2 2の 5 x g を 、 中 塩濃度緩衝液中で 、 制 限酵素 A va I 及び P vu I ( いず れも宝酒造㈱製 ） で切 断 し 、 フ エ ノ ール抽出後 、 D N A ポ リ メ ラ ーゼ I ( ク レ ノ ー 断片、 宝酒造㈱製 ） で切断断 片をブラ ン 卜 エ ン ド化 し た 。 次 に 1 . 096ァ ガ ロ ー スゲ ル電気泳動で約 3 . 7 2 の 0 八 断片を分離 し 、 し の 断片を T 4 D N Aリ ガ ーゼで環状化さ せ た 。 反応終了後 こ の反応組成液で H B 1 0 1 株を形質転換 し 、 得 ら れる ア ン ピ シ リ ン耐性及びテ 卜 ラサイ ク リ ン耐性を示す形質 転換株の 中 か ら 一株を選択 し て プラ ス ミ ドを単離 し p B R H 0 2を得た 。 得 ら れた P B R H 0 2 は 、 P B R 3 2 2 と は異なっ て 、 A valで も Ρ νιιϋでも切 断さ れな かっ た 。
    [0187] ② 上記①で得た P B R H 0 2の 5 xz g を制 限酵素 P st •I及び B amH I ( いず れも宝酒造㈱製 ） を用 い て 中塩濂 度緩衝液中で切 断 し 、 次いで 1 . 0 %ァガ ロ ー スゲル電 気泳動 を行なっ て 、 約 2 . 6 0 kbの D N A断片 《 D》 を 分離 し た 。
    [0188] こ の 断片 は 、 テ 卜 ラサイ ク リ ン耐性遺伝子の一部及び プラ ス ミ ド の複製開始頜域を含んでい る 。
    [0189] ③ P G H 5 4の 1 0 ^ g を制 眼酵素 P stl 及び B am H I で、 中塩濃度緩衝液を用 い て 切 断 し 、 次いで 1 . 0
    [0190] °/0 ァ ガ ロ ースゲル電気泳動 を行な い 、 約 0 . 6 6 k bの D N A断片 《 E 》 を得た
    [0191] こ の 断片に は 、 /3 — ラ ク タ マ ー ゼのプ ロ モ ー タ ー 、 リ ポゾー ム結合部位、 シ グナルペプチ ドを コ ー ドする D N A配列及ぴテ 卜 ラ サイ ク リ ン耐性遺伝子の一部が含 ま れて いる 。
    [0192] ④ 上記で得た 2つ の 断片 《 D 》 及び 《 E 》 を 、 T 4 D N A リ ガ ー ゼ を用 い て 結合さ せ た 。 反応後、 こ の反応 組成液で H B 1 0 1 株を形質転換 し た 。 得 ら れた テ 卜 ラ サイ ク リ ン耐性を示す形質転換株の中か ら 1 株を選びプ ラ ス ミ ドを単離 し た 。 か く し て P G H 5 5 を得た 。
    [0193] —連の操作の概略 は 、 第 3 図 に示さ れる通 り で あ る 。 第 3 図 は P B R 3 2 2か ら P B R H 0 2 を得、 の
    [0194] P B R H 0 2 と P G H 5 4 と か ら 本発明ポ リ ペプ チ ド分 泌発現用 ベ ク タ ー P G H 5 5 を得る 工程及び得 ら れる P G H 5 5 の特性を示す 図で あ る 。
    [0195] P G H 5 5 は 、 上記第 3 図 に 示さ れる制限酵素開裂地 図 に よ り 特徴付け ら れ 、 1 . 0 % ァ ガ ロ ー スゲル電気泳 動 の結果、 約 3 . 3 K b の大き さ を有 し て い た 。 ま た 該 P G H 5 5 は 、 3 法 に よ る塩基配列分析の結果、 P G H 5 4 に お け る第 2 の P vul制 限サイ 卜 を含む約 0 . 6 4 kbの D N Aを欠 く 以外 は 、 該 P G H 5 4 と周様 で あ り 、 その第 1 の Ρ νυ II制限サイ 卜 は 、 シ グナルぺプ チ ド を コ ー ド する. D N A塩基配列の 3 ' 末端の近傍に存 在 し て いる こ と が確認された 。
    [0196] 実施例 2
    [0197] シ グナルペプチ ド — 3 ゥ ロ ガス 卜 ロ ン融合ポ リ ぺプチ ドを コ ー ド す る D N A塩基配列 を有する分泌発現べ ク タ ー の構築
    [0198] { A ) ゥ ロ ガス 卜 ロ ンを コ ー ドする D N A塩基配列 の合成
    [0199] こ の塩基配列 は 、 グ レ ゴ リ ー （ H . G regory) に よ り 報告さ れた ア ミ ノ 酸配列 〔 N ature, 2 5 7 , 3 2 5 — 3 2 7 ( 1 9 7 5 ) 〕 を参考に し て 、 ま ず /3 ゥ ロ ガス 卜 ロ ンを コ ー ド する D N A塩基配列の前後に 開始コ ド ン 、 終止 コ ド ン及び制 限酵素認識部位を付加 し て な る下記第 3表 に示す D N A塩基配列を構築する こ と よ り 行なっ た c こ の D N A塩基配列 は 、 本発明者 ら に よ り 既に特顥昭 5 9 — 1 3 7 6 9 1 号 と し て特許出顥さ れて い る 。 第 3 表
    [0200] 5' AAT TCG AAG ATC TGC ATG AAT AGC
    [0201] 3' GC TTC TAG ACG TAC TTA TGG
    [0202] GAT TCT GAG TGC CCA CTG TCT CAC
    [0203] CTA AGA CTC ACG GGT GAC AGA GTG
    [0204] GAT GGC TAT TGT CTG CAG GAC GGT
    [0205] CTA CCG ATA ACA GAC GTG CTG CCA
    [0206] GTT TGC ATG TAC ATC GAA GCT TTG
    [0207] CAA ACG TAC ATG TAG CTT CGA AAC
    [0208] GAT AAA TAC GCG TGT AAC TGT GTA
    [0209] CTA TTT ATG CGC ACA TTG ACA CAT
    [0210] GTG GGT TAT ATC GGT GAA CGC TGT
    [0211] CAC CCA ATA TAG CCA CTT GCG ACA
    [0212] CAA TAC CGT GAT CTG AAA TGG TGG
    [0213] GTT ATG GCA CTA GAC TTT ACC ACC
    [0214] GAA TTG CGT TAA TAG TGA AGA TCT
    [0215] CTT AAC GCA ATT ATC ACT TCT AGA
    [0216] G 3'
    [0217] CCT AG 5'
    [0218] ( B ) iS ゥ ロ ガ ス 卜 ロ ン を コ ー ド する D N A塩基配列 を保有 す るプ ラ ス ミ ド の 構築 P B R 3 2 2 の 1 0 g を 、 ま ず高塩濃度緩衝液中 で E coR I ( 宝酒造㈱製 ） と B amH I とで切断 し 、 次い で 1 . 0 %ァガ ロ ー スゲル電気泳動を行なっ て 、 約 3 . 9 9 の D N A断片を単離 し た 。
    [0219] ② 上記①で得た D N A断片 と 、 上記 （ A ) で得た 3 ゥ 口 ガ ス 卜 ロ ンを コ ー ドす る D N A塩基配列 と を 、 T 4 D N A リ ガ ー ゼで結合さ せた 。 反応後、 反応組成物で Η Β 1 0 1 株を形質転換 し 、 得 ら れた ア ン ピ シ リ ン耐性 を示す形質転換株の中 か ら一株を選びプラ ス ミ ドを単離 した 。 か く し て 3 ゥ ロ ガス 卜 ロ ンを コ ー ドする D N A塩 基配列 を P B R 3 2 2 の E coR I 及び B amH I 制 眼サイ 卜 間 に 挿入さ れた プラ ス ミ ド P U G 3 を得た 。
    [0220] のプラ ス ミ ド P U G 3 を保有する H B 1 0 1 株 は 、
    [0221] Γ Η Β 1 0 1 ( U G 3 ) 」 な る表示で 、 微 ェ研菌条第 5 4 3号 （ F E R M B P — 5 4 3 ) と し て 寄託さ れて い る 。
    [0222] ( C ) P U G 2 0 1 の構築
    [0223] 上記 （ B ) で得 た p U G 3 を制 限酵素 H ί n f I で切 断 し て 得 ら れる D N A断片を 、 P G H 5 5 の P vul制 限サ ィ 卜 に 挿入 し て 、 シ グナルペプチ ド 一 /3 ゥ 口 ガ ス 卜 ロ ン 融合 ポ リ ペプチ ド を コ ー ド する D N A塩基配列を含む分 泌発現べ ク タ 一 で あ る P U G 2 0 1 を 、 以下の方法 に よ り 構築 し た 。
    [0224] ① P U G 3 の 1 5 g を 、 髙塭 S度緩衝液中で H inf
    [0225] I ( 宝酒造㈱製 ） で切断 し 、 フ エ ノ ー ル油出後 、 D N A ' ポ リ メ ラ ーゼ I ( ク レ ノ ー 断片 ） で 切断断片を ブラ ン 卜 エ ン ド 化 し た 。 次いで 6 % ポ リ ア ク リ ルア ミ ドゲル電気 泳動 を行ない 、 約 0 . 4 3 kbの D N A靳片 《 F 》 を単離 し た 。
    [0226] こ の 断片 に は 、 3 ゥ ロ ガ ス 卜 ロ ン を コ ー ド す る D N A 塩基配列 〈 翻訳停止 コ ド ン を含む ） の う ち 5 ' 端の 7塭 基を 除 く 塩基配列 が含 ま れ て い た 。
    [0227] ② P G H 5 5 は 、 3 ラ ク タ マ ー ゼ の シグ ナルペプチ ド を コ ー ド する D N A塩基配列 の後 に 、 3 ゥ ロ ガ ス 卜 ロ ン の N端領域を コ ー ド す る最初 の 7個 の D N A塩基配列 が 直結 し 、 且つ そ の直後で制 限酵素 P VII E に よ り'切 新さ れ る よ う に 構成さ れた D N A塩基配列 を有す る も の で あ り . 該 P G H 5 5 の 5 / g を 中塩濃度緩衝液中で 、 P vulで 切 断 し て 、 約 3 . 2 6 kbの D N A断片 《 G》 を得 た 。
    [0228] こ の 断片は 、 p G H 5 5 の全て の遛伝情報を 有 し て い る 。
    [0229] ③ 上記①で 得 た 断片 《 F 》 の約 1 g と 上記②で得た 断片 《 G》 の約 0 . 5 ^ g と を 丁 4 D N A リ ガ ー ゼ で結 合さ せた 。 反応後、 こ の反応組成液で H B 1 0 1 株を形 質転換 し 、 得 ら れる テ 卜 ラサイ ク リ ン耐性の形質転換株 の中か ら一株を選び、 プラ ス ミ ド p U G 2 0 1 を単離 し た 。
    [0230] —連の操作の概略 は 、 第 4 図 に示さ れる通 り である 。 第 4 図 は 、 P G H 5 5 と P U G 3 と か ら シグナルぺプ チ ド と 目 的ポ リ ペプチ ド （ jS ゥ ロ ガス 卜 ロ ン ） と の融合 ポ リ ペプチ ド を コ ー ド す る D N A塩基配列を含む本発明 ポ リ ペプチ ド分泌発現ベ ク タ ー P U G 2 0 1 を得る工程 及び得 ら れる P U G 2 0 1 の特性を示す図で あ り 、 図中 白 ヌ キ の矢印 は- jS ゥ ロ ガス 卜 ロ ンの遣伝子を示す 。
    [0231] P U G 2 0 1 は 、 1 . 0 % ァガ ロ ー スゲル電気泳動の 結果、 約 3 . 7 K b の大き さ を有 し て い た 。 こ れを B am H I 又 は H ind Iで切断する と 、 そ れぞれ 2種類の D N A断片が得 ら れる こ と か ら 、 該 P U G 2 0 1 に は 3 ゥ 口 ガ ス 卜 ロ ン遺伝子が含 ま れて い る こ と が判 り 、 ま た 該断片の大き さ を調べた結果よ り 、 目 的のプラ ス ミ ドで あ る こ と が判っ た 。 更 に 、 p U G 2 0 1 に つ い て 、 3 ラ ク タ マ ーゼ のプ ロ モ ー タ ー 部分か ら 3 ゥ ロ ガス 卜 ロ ン遛 伝子 ま で を含む D N A断片の 塩基配列 を 、 M 1 3 法 に よ る塩基配列分析 に よ り 調 べ た 。 そ の結果 、 該 D N A塩基 配列 は下記第 4窣の通 り であ り 、 p U G 2 0 1 がプ ロ モ 一タ ー 、 リ ボゾ ー ム結合部位並び に /3 ラ ク タ マ ー ゼ の シ グ ナルペプチ ド を コ ー ド する塩基配列及び 3 ゥ 口 ガ ス 卜 ロ ン を コ ー ド す る 塩基配列 （ 融合ポ リ ペ プチ ド を コ ー ド する塩基配列 ） が 、 正確 に こ の順序で配列 さ れて い る し と が確認 さ れた 。 ま た第 4表 に は D N A塩基配列 に 対応 す る ア ミ ノ 酸配列も併記す る 。
    [0232] 上記 P U G 2 0 1 は 、 こ れを大腸菌 H B 1 0 1 に 保有 さ せ 、 こ の保有株を Γ Η Β 1 0 Ί 〔 P G H 2 0 1 〕 」 な る 表示で 、 通商産業省工業技術院微生物 工 業研究所 に 寄 託さ れて い る 。 その寄託番号 は 、 微ェ研条寄第 6 8 1 号 ( F E M B P — 6 8 1 〉 で あ る 。
    [0233] 第 4 表
    [0234] プ □ タ
    [0235]
    [0236] Jポゾー厶結合部位
    [0237] AAGGAAGAGT ATG AGT ATT CAA CAT TTCCTTCTCA
    [0238]
    [0239] TTC CGT GTC GCC CTT ATT CCC TTT
    [0240] AAG GCA CAG CGG GAA TAA GGG AAA
    [0241] Phe Arg Val Ala Leu I le Pro Phe シ グ ナ ル ぺ プ チ 丁 ττ GCG GCC TTT TGC CTT CCT GTC
    [0242] AAA CGC CGG AAA ACG GAA GGA CAG
    [0243] Phe Ala Ala Phe Cys Leu Pro Val
    [0244] TTC GCG AAC TCA GAT TCT GAG TGC
    [0245] AAG CGC TTG AGT CTA AGA CTC ACG
    [0246] Phe Ala Asn Ser Asp Ser Glu Cys
    [0247] CCA CTG TCT CAC GAT GGC TAT TGT
    [0248] GGT GAC AGA GTG CTA CCG ATA ACA
    [0249] Pro し en Ser His Asp Gly Tvr Cys
    [0250] .Sゥ口ガス卜ロンのポリぺプチド
    [0251] CTG CAC GAC GGT GTT TGC ATG TAC
    [0252] GAC GTG CTG CCA CAA ACG 丁 AC ATG
    [0253] Leu His Asp Gly Val Cys et Tyr β 0 ' 0 し マ 4 S 通 /: Γι ^ ¾ β 0 ' s ¾ ¾ し ♦ 遝 エ ^ β S ' 0 ¾ ^ Ζ ♦ 7 ^ ^ ^ ^ ^ ¾S
    [0254] < ( ^ ¾ © C) δ I ) 5ί ¾ 3
    [0255] 簦 ¾ 09 ^ し 0 し 8 4 §真 ¾ ¾ し 0 5 9 门 （1 ( V )
    [0256] S ¾ ^ Cfl □ Η # ロ £ / 璲 ^ 3雇 ^ し Ο δ Θ ΓΊ d
    [0257] 〇 丄0〇¥〇 丄0丄丄〇 〇丄
    [0258] 6JV Γ)91 n|0 dj丄 ηθη
    [0259] 丄丄 V VOO OVV 丄丄 0 00V 00V 丄丄丄 OVO
    [0260] VV丄 100 9丄丄 VVO 03丄 ΘΘ丄 VVV 0丄 0 dsy 6J V 」Λ丄 U|〇 6J V n|〇 Λ|〇
    [0261] V丄〇 VOO 。丄 V 丄丄〇 VOV ΘΟΘ 丄丄 0 VOO
    [0262] 丄 VE) 丄 E)0 QV丄 VVO 101 000 VVO 丄 90
    [0263] 8| I JA丄 Λ|〇 ΙΒΛ SAQ usv SAO
    [0264] ΘΥ1 V丄 V VOO OVO IVO VOV 。丄丄 VOV
    [0265] 0丄 V 丄 V丄 100 〇丄〇 V丄 Θ 101 OVV 101
    [0266] BIV 」Λ丄 SA1 dsv B|V ΠΙΘ θ| I
    [0267] 000 ε>丄 V 丄丄丄 V丄 Q OVV VOO 丄丄 0 OVl
    [0268] ΘΟΘ VVV 丄 ve» 0丄丄 丄 09 VVO 0丄 V
    [0269] 9 9
    [0270] 96900/S8df/lDd 6LL£Q/9S O リ ン酸水素 ア ン モニ ゥ ム ♦ ナ 卜 リ ウ ム
    [0271] 4 水塩 3 . 5 g プ ド ウ糖 2 . 0 g カ ザ ミ ノ 酸 0 g
    [0272] L 一 プ ロ リ ン 0 . 2 3 g し 一 口 イ シ ン 3 9 . 5 mg 塩酸チ ア ミ ン 1 6 . 8 5 mg テ 卜 ラ サイ ク リ ン ♦ 塩酸塩 2 0 . 0 mg
    [0273] P U G 2 0 1 株の前培養液 Ί υιΰを 、 修正 Ε 培地 2 0 0 mQを含む フ ラ ス コ に 加 え 、 3 7 °Cで 2 4 時間振盪培養 し た 。
    [0274] ( B ) 菌体か ら の ペ リ プラズム画分 と 細胞内画分 と の 抽 出
    [0275] 上記 （ A ) で 得た培養液か ら 遠心分離 （ 6 0 0 0 回 転 Z分 X 1 0分 ） で菌体を集め 、 培養液の 0 . 5 倍量の洗 淨緩衝液 〈 Ί 0 m M 卜 リ ス塩酸及び 3 ◦ m M塩化ナ 卜 リ ゥ ム 、 p H 8 . 0 ) で菌体を 洗浄 し た後 、 浸透圧 シ ョ ッ ク 法 〔 H . C . N euと し . A . H eppel , J . B . C .， 2 4 0 ， 3 6 8 5 - 3 6 9 2 ( 1 9 6 5 ) 〕 に 従い 、 ぺ リ ブ ラズ 厶 画分を 油 出 し た の抽 出 操作は 、 ま ず湿
    [0276] 1 9 の菌体を 2 0 %蔗糖を含む 3 0 m M 卜 リ ス塩酸緩 衝液 （ P H 8 . 0 ) 8 0 ιηδに懸濁 さ せ 、 0 . 2 5 Μ E D T A水溶液 （ Ρ Η 8 . 0 ) の Q . 3 2 m2を加 え 、 ロ ー タ リ ー シ ェ ー カ ー で 2 4で に て 1 8 0回転 /分で 1 0分間攬拌 し た 後 、 遠心分離 （ 9 0 0 0回転 /分 X 1 0分 ） し て菌体を集め 、 次いで こ の菌体を氷冷 し た水 8 012に 再懸濁 さ せ 、 氷中 に 1 0分間 静置 し て 時々 攬拌 し 、 遠心分離 （ 9 0 0 0回転 /分 X 1 0分 ） に よ り 菌体 と 上澄 と を分離 す る こ と に よ り 行なっ た も ので あ り 、 得 ら れ た 上澄が ペ リ ブラ ズム画分で あ る
    [0277] 次い で 、 上記ペ リ プ ラ ズ ム 画分を抽 出 し た後の 菌体を 前記 と 同一 の洗净緩衝液で洗净後 、 P B S ( 1 5 0 m M 塩化 ナ ト リ ウ ム を 含む 2 0 m M リ ン酸ナ ト リ ウ ム 、 p H 7 . 0 ) 6 に 懸濁 さ せ 、 迢音波破砕機 （ 大岳製作所製 5 2 0 2 型 ） を用 い て 出力 1 0 0 Wに て 3 0秒ず つ 3 回 超音波破砕処理 し 心分離 （ 1 8 0 0 0回転 Ζ分 X
    [0278] 2 〇 分 ） し て 上澄 を得た れを細胞内 画分 と し た
    [0279] ( C ) ラ ジ オ ィ ム ノ ア ッ セ ィ に よ る 3 ゥ ロ ガ ス 卜 ロ ン の 測定
    [0280] 上記 （ Β ) で 得た そ れぞれの 分 につ き 、 以下の通 り 3 ゥ ロ ガ ス 卜 ロ ン の 存在 を 、 ゥ ロ ガ ス 卜 ロ ン特異 ラ ジ オ イ ム ノ ア ツ.セ ィ に よ り 検討 し た 。 ラ ジ オ ィ ム ノ ア ッ セ ィ の方法は次の通 り である 。 即 ち 、 精製 ヒ 卜 iS ゥ ロ ガス 卜 ロ ンを抗原 と し て 、 家兎を免疫 し 抗血清を作成 し た 。 3 ゥ 口 ガ ス 卜 ロ ン を蒸留水 0. 2 in2に 溶解後 5 0 % ポ リ ビ ニル ピ ロ リ ド ン液 1 . 5 ιπδを加 え室温で 2 時間撹拌 し た 。 コ ンプ リ ー ト · フ ロ イ ン ド ♦ ア ジ ュバ ン 卜 2 . Ο πιδを加 え て 乳化 し 、 家兎 3 匹の胸部に 皮下注射 し た 。 2週間毎に免疫を 4 回 く り 返 し た後、 さ ら に 5 0 g の抗原を静注 し 、 3 日 後 に全採血を行ない 、 血清を 分離 し た 。
    [0281] 次 に ア ツ セ ィ に 用 いる抗血清の希釈倍率を求める タ イ 卜 レ ー シ ヨ ン カ ー プ 、 ア ツ セ ィ 条件を最適化す る た め ィ ンキ ュ ベ ー シ ヨ ン 時間 、 抗体結合標識抗原 （ バ ウ ン ド ） と 遊離標識抗原 （ フ リ ー ） の分離方法等の検討を加 え 、 下記測定条件を設定 し た 。
    [0282] 即 ち 、 0 . 5 % ゥ シ血清 アルブ ミ ン （ B S A ) 、
    [0283] 1 4 0 m M塭化ナ ト リ ウ ム 、 2 5 m M D T Aニ ナ 卜 リ ウ 厶 を含む 1 0 m M リ ン酸緩衝液 （ P H 7 . 4 ) を希 釈液 と し て用 い 、 該希积液 4 0 0 ^ 2 、 測定試料又 は標 準 ヒ 卜 3 ゥ ロ ガ ス 卜 ロ ン 1 0 0 S 及び抗 ヒ 卜 3 ゥ ロ ガ ス 卜 ロ ン血清 1 0 0 ^ 2 を加 え て 4 °Cに て 2 4 時間 イ ン キ ュ ベ 一 卜 し た 後 、 1 2 5 I 標識 ヒ 卜 3 ゥ ロ ガ ス 卜 ロ ン 1 0 0 X 2 ( 約 5 〇 0 〇 cpm ) 加 え た 。 更 に 4 °C に て 4 8 時間 イ ン キ ュ ベ ー 卜 し fc後 、 第 2 抗体 （ 抗家兎 ァ ー グ ロ プ リ ン ャ ギ血清 ） （ 1 ： 2 0 ) 1 0 0 ^ 2 、 正常家 兎血清 （ 1 : 2 0 0 ) 1 0 0 δ 及び 5 % ポ リ エ チ レ ン グ リ コ ールを含む 1 0 m M P B S 液 9 0 0 〃 2 を加 え て 4 °C に て 3 時間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た 。 次 に 3 0 0 0 rpm で 3 0 分間遠心分離 し 、 上清を除き沈瀕物を カ ウ ン 卜 し た 。 標準 ヒ 卜 3 ゥ 口 ガ ス 卜 ロ ン よ り 得 ら れた 標準曲 線 よ り 試料中の ヒ 卜 3 ゥ ロ ガ ス 卜 ロ ン免疫活性物の含量 を 求め た 。
    [0284] 上記結果を下記第 5 表 に 示す 。 ま た 第 5 表に は 、 P U G 2 0 1 を保有す る H B 1 0 1 株に 代え て 、 周様 に し て 作成さ れた P G H 5 5 及び p U G 3 のそれぞれで形 質転換 さ れた H B 1 0 1 株を用 い て 同様 に し た結果を併 記 す る 。
    [0285] 第 5 表
    [0286] 3 ゥ ロ ガ ス 卜 ロ ン免疫活性 株 ( g / s 培養液 ）
    [0287] ペ リ ブラズ ム画分—細胞内画分
    [0288] Η Β 1 0 1
    [0289] C P G Η 5 5 ) < 0 . 0 3 < 0 . 0 3
    [0290] Η Β 1 0 1
    [0291] 〔 P U G 3 ) < 0 . 0 3 < 0 . 0 3
    [0292] Η Β 1 0 1
    [0293] ( U G 2 0 ) 2 6 3 0 ._6 2一 上記第 5表 よ り 、 シ グナルペプチ ドの みを コ ー ド す る D N A塩基配列 を含むベ ク タ ー を保有する大腸菌 （ Η Β 1 0 1 ( G Η 5 5 ) ) 及び ゥ ロ ガ ス ト ロ ン の みを コ - ド す る D M A塩基配列 を含むプラ ス ミ ド を保有す る大 腸菌 （ H B 1 0 1 ( U G 3 ) で は 、 そ れ ら の培養抽 出液中 に 3 ゥ ロ ガ ス 卜 口 ン の免疫活性物質は実質的 に 検 出 さ れない が 、 シ グナルペプチ ド と 3 ゥ ロ ガ ス 卜 ロ ン の 融合ポ リ ペ プチ ド を コ ー ド す る D N A塩基配列 を含み 、 そ の前に プ ロ モ ー タ ー 及び リ ボゾー ム結 合部位が連結さ れた 本発明 の成熟 ポ リ ペプチ ド分泌発現ベ ク タ ー を 保有 す る大腸菌 （ H B 1 0 1 ( U G 2 0 1 ：) で は 、 そ の 培養抽出液中 に 顕著な 5 ゥ ロ ガ ス 卜 口 ンの免疫活性が検 出 さ れる こ と が 明 ら かで あ る 。
    [0294] ま た 本発明ベ ク タ ー で形質転換 し た上記微生物の培養 で は 、 3 ゥ ロ ガ ス 卜 ロ ンの免疫活性物質の殆ん ど す ベ て ( 9 9 . 8 % ) が 、 ペ リ ブラズ ム に 分布 し て い る こ と も 確認さ れる 。 こ の こ と か ら 、 シグ ナルペプチ ド と 3 ゥ ロ ガ ス 卜 ロ ン と の融合ポ リ ペプ チ ドの D N A 塩基配列 を利 用 し た 本発明 に よ れば、 /3 ゥ ロ ガ ス 卜 ロ ン は細胞膜を通 過 し て ペ リ プラ ズム に分泌さ れる こ と が判る 。
    [0295] ( D ) ポ リ ペプチ ド の精製
    [0296] 上記ペ リ ブラ ズム抽 出液中 の 3 ゥ 口 ガ ス 卜 ロ ン の免疫 活性物質を 、 プチル 卜 ョ パ ー ル （ 東洋曹達㈱製 ） を用 い た 吸着 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー 、 C M — 卜 ョ パ ー ル （ 東洋曹 達株式会社製 ） を用 い た イ オ ン交換 ク ロ マ ト グラ フ ィ ー P e p R P C カ ラ ム （ フ ア ルマ シ ア社製 ） を用 い た 髙速液 体 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー 操作 に よ り 、 そ れぞれ単一 の ポ リ ペプチ ド に なる ま で精製 し た 。
    [0297] そ の結果、 精製さ れた ポ リ ペ プチ ド は 、 ポ リ ア ク リ ル ア ミ ドゲル電気泳動 、 S D S — ポ リ ア ク リ ル ア ミ ド ゲル 電気泳動 、 ア ミ ノ 酸分析 、 N 末端分析の す べ て に お い て ヒ 卜 尿 よ り 単離精製さ れた 3 ゥ 口 ガ ス 卜 ロ ン と 周一物質 であ る こ とが確認 された
    [0298] ffiJIS様式 INTERNATIONAL FORM
    [0299] BUDAPEST TREATY ON THE INTERNATIONAL RECOGNITION OF THE DEPOSIT
    [0300] 特許手垸上の微生物の寄託の国際的承 12 OF MICROORGANISMS FOR THE PURPOSES
    [0301] OF PATENT PROCEDURE
    [0302] 、に関するブダべスト条約
    [0303] RECEIPT IN THE CASE OF AN ORIGINAL
    [0304] 下記国際寄託当局によって規則 7. 1に従い
    [0305] DEPOSIT
    [0306] 発行される
    [0307] issued pursuant to Rule 7. 1 by the INTERNA原寄託についての受託証 TIONAL DEPOSITARY AUTHORITY identified at the bottom of this page. 氏名 （名称） アース製薬铣式会社
    [0308] あ て 名兵庫県赤穂市坂越 3 2 1 8の 1 2
    [0309] I . 微生物の表示
    [0310] (寄託者が付した識別のための表示） (受託番号）
    [0311] 微ェ研条寄第 6 7 8 号
    [0312] HB101 pGH53
    [0313] (FERM BP -6 7 8 )
    [0314] Π . 科学的性質及び分類学上の位置
    [0315] I欄の微生物には， 次の事項を記載した文書が添付されていた
    [0316] Ξ 科学的性質
    [0317] 分頷学上の位置
    [0318] πι. 受頡及び受託 本国際寄託当局は， 昭和 59 年 12 月 13 曰 （原寄託日）に受領した I櫧の微生物を 受託する。
    [0319] IV. 国際寄託当局
    [0320] 通商苣業省工業技術院微生物工業技術研究所 名 "Γ小-
    [0321] あて名：
    [0322]
    [0323] 305, JAPAN
    [0324] 昭和 59 年 （1984 ) 12 月 13 日 国際様式 INTERNATIONAL FORM
    [0325] BUDAPEST TREATY ON THE INTERNATIONAL RECOGNITION OF THE DEPOSIT OF MICROORGANISMS FOR THE PURPOSES
    [0326] 特許手铳上の微生物の寄託の国際的承認
    [0327] OF PATENT PROCEDURE
    [0328] 、に関するブダぺス卜条約
    [0329] RECEIPT IN THE CASE OF AN ORIGINAL
    [0330] 下記国際寄託当局によつて規則 7.〗に従い
    [0331] DEPOSIT
    [0332] 発行される
    [0333] issued pursuant to Rule 7. 1 by the INTERNA原寄託についての受託証 TIONAL DEPOSITARY AUTHORITY identified at the bottom of this page.
    [0334] 氏名 （名称） アース製薬株式会社
    [0335] - あ て 名兵庫県赤穂巿坂越 3 2 1 8の Ί 2
    [0336] I . 微生物の表示
    [0337] (寄託者が付した識別のための表示） (受託番号）
    [0338] HB10l fpGH54 微ェ研条寄第 6 7 9 号
    [0339] (FERM BP - 6 7 9 )
    [0340] I. 科学的性質及び分類学上の位置
    [0341] I欄の微生物には， 次の事項を記載した文書が添付されていた c
    [0342] □ 科学的性質
    [0343] Q 分類学上の位置
    [0344] I. 受領及び受託
    [0345] " 本国際寄託当局は， 昭和 59 年 12 月 13 曰 （原寄託ョ）に受領した 1搠の微生物を 受託する。
    [0346] IV. 国際寄託当局
    [0347] 通商苣業省工業技術院微生物工業技術研究所 名 称
    [0348] あて名
    [0349]
    [0350] 305, JAPAN
    [0351] 昭和 59 年 （1 984 ) 1 2月 13 曰 国際様式 INTERNATIONAL FORM
    [0352] BUDAPEST TREATY ON THE INTERNATIONAL RECOGNITION OF THE DEPOSIT
    [0353] f OF MICROORGANISMS FOR THE PURPOSES 特許手垸上の ¾主物の寄託の国際的承認
    [0354] OF PATENT PROCEDURE
    [0355] 、に関するブダへフ、ト 約 )
    [0356] RECEIPT IN THE CASE OF AN ORIGINAL
    [0357] 下記国際？ ί託当局によって規 7. 1に従い
    [0358] DEPOSIT
    [0359] 発行される issued pursuant to Rule 7. 1 by the INTERNA原寄託についての受託証 TIONAL DEPOSITARY AUTHORITY identified at the bottom of this page. 氏名 （名称） アース製薬株式会社
    [0360] 寄託者
    [0361] あ て 名 兵庫県赤穂巿坂越 3 2 1 8の 1 2
    [0362] I . 微生物の ¾不
    [0363] (寄託者が付した識別のための表示） (受託番号）
    [0364] HB1 01 (pGH55 微ェ研条寄 ·6 8 0 号'
    [0365] (FERM BP - 6 8 0 )
    [0366] Π . 科学的性質及び分類学上の位置
    [0367] I欄の微生物には， 次の事項を記載した文書が添付されていた
    [0368] 0 科学的性質 ，
    [0369] 分類学上の位置
    [0370] I . 受領及び受託 本国際寄託当局は， 昭和 59 年 1 2 月 Ί 3 日 （原寄託曰）に受領した I搠の微生物を 受託する。
    [0371] IV. 国際寄託当局
    [0372] 通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所
    [0373] Fennentatiofl— Receaich-Iastitute
    [0374] 名 称： Agency of Industrial acienccand. [Technology
    [0375] . , , !リ. ! 千 ！ ！
    [0376] 所 長 大 山 次 郎 ^ミ^ i
    [0377] Jiro Ooyama, r. : "TiDTRECTOR GENERAL.
    [0378] あて名：曰本国茨城県筑波郡谷田部 BJ東 Γ,目 ； (郵便番号 305 )
    [0379] 1-3 , Higashi 1 chome Vatabe-macfti isukuba-gun Ibaraki-ken
    [0380] 305, JAPAN .
    [0381] 昭和 59 年 （1 984 ) 12月 13 曰 国際様式 INTERNATIONAL FORM
    [0382] BUDAPEST TREATY ON THE INTERNATIONAL RECOGNITION OF THE DEPOSIT
    [0383] f OF MICROORGANISMS FOR THE PURPOSES 特許手続上の微生物の寄託の国際的承認
    [0384] OF PATENT PROCEDURE
    [0385] ^こ関するブダぺス ト条約
    [0386] RECEIPT IN THE CASE OF AN ORIGINAL
    [0387] 下記国際寄託当局によって規則 7.〗に従い
    [0388] DEPOSIT
    [0389] 発行される
    [0390] issued pursuant to Rule 7. 1 by the INTERNA¬
    [0391] - 原寄託についての受託証 TIONAL DEPOSITARY AUTHORITY identified at the bottom of this page. 氏名 （名称） アース製薬珠式会社
    [0392] あ て 名兵庫県赤穂市坂越 3 2 1 8の 1 2
    [0393] I . 微生物の表示
    [0394] (寄託者が付した識別のための表示） (受託番号）
    [0395] HB101 fpUG20l) 微ェ研条寄第 6 8 1 号
    [0396] (FERM BP - 6 8 1 )
    [0397] I . 科学的性質及び分類学上の位置
    [0398] I欄の微生物には， 次の事項を記載した文書が添付されていた <：
    [0399] Q 科学的性質
    [0400] Q 分類学上の位置
    [0401] 1. 受領及び受託 本国際寄託当局は， 昭和 59 年 12 月 13 曰 （原寄託日）に受領した I欄の微生物を 受託する。
    [0402] IV. 国際寄託当局
    [0403] 通商苣業省工業技術院微生物工業技術研究所 名 称：
    [0404] あて名：
    [0405]
    [0406] 305, JAPAN
    [0407] 昭和 59年 （ 1984 ) 12月 13 曰
    权利要求:
    Claims
    請 求 の 範 囲
    ① シグナルペプチ ド を コ ー ド す る D N A塩基配列 と 目 的ポ リ ペプチ ドを コ ー ドす る D N A塩基配列 と を直接 連結さ せ て 目 的ポ リ ペプチ ド を分泌発現さ せる た め の シグナルペプチ ドを コ ー ド す る D N A塩基配列を含む こ と を特徴 と す る ポ リ ペ プチ ド分泌発現用 ベ ク タ ー 。
    ② シグナルペプチ ド を コ ー ド する D N A塩基配列 と共 に 該塩基配列 の前 に プ ロ モ ー タ ー 及び リ ポゾ ー ム結合 部位を有する特許請求の範囲第 1 項 に記載のベ ク タ ー ③ シ グ ナルペプ チ ド を コ ー ド す る D N A塩基配列 に 連 結さ れる べ き 目 的 ポ リ ペプチ ドを コ ー ド す る D N A塩 基配列 の 直後 に 翻訳停止シ グナルを直接連結さ れ る べ く し た 特許請求の範囲第 1 項又 は第 2 項に 記載の べ ク タ 一 。
    ④ 翻 訳停止シ グナルの後 に更 に転写終結因子が連結さ れて な る特許請求の範囲第 3 項 に 記載の ベ ク タ ー 。 ⑤ シ グ ナ ルペプチ ド が大腸菌 3 ラ ク タ マ 一 ゼ の も ので あ る特許請求の範囲第 1 〜 4 項の い ず れか に 記載の ベ ク タ 一 。
    ⑥ プ ロ モ ー タ ー 、 リ ボゾー ム結合部位及び転写終結因 子が大腸菌 3 ラ ク タ マ ー ゼ の も の で あ る特許請求の範 囲第 1 〜 5 項の いずれか に 記載のベ ク タ ー 。
    ⑦ P G H 5 4 である特許請求の範囲第 1 項に 記載の ベ ク タ一。
    ⑧ P G H 5 5 で ある特許請求の範囲第 1 項 に 記載の ベ ク タ一。
    ⑨ シグナルペプチ ドを コ ー ド する D N A塩基配列 と 目 的ポ リ ペプチ ド を コ ー ドす る D N A塩基配列 と が直接 連結さ れてなる融合ポ リ ペプチ ドを コ ー ドする D N A 塩基配列 を含むこ と を特徴と する特許請求の範囲第 1 〜 9 項の いずれか に 記載のベ ク タ ー 。
    ⑩ 目 的ポ リ ペプチ ド を コ ー ド す る D N A塩基配列 が 3 ゥ ロ ガ ス 卜 ロ ンを コ ー ドする ものであ る特許請求の範 囲第 9 項 に 記載の ベ ク タ ー 。
    © P U G 2 0 1 で あ る特許請求の範囲第 9 項 に 記載の ベ ク タ ー 。
    @ シグナルペプチ ドを コ ー ド する D N A塩基配列 と 目 的ポ リ ペプチ ドを コ ー ド す る D N A塩基配列 と が 直接 連結さ れて なる融合ポ リ ペプチ ド を コ ー ドす る D N A 塩基配列 を含むベ ク タ 一で形質転換さ れた微生物 。 ⑩ 大腸菌であ る特許請求の範囲第 1 2 項 に記載の微生 物 。 ® シ グナルペプチ ド を コ ー ド す る D N A塩基配列 と 目 的ポ リ ペプチ ド を コ ー ド す る D N A塩基配列 と が直接 連結さ れて なる融合ポ リ ペプチ ド を コ ー ドす る D N A 塩基配列を含むベ ク タ ー で形質転換さ れた微生物 を培 養 し て分泌さ れる ポ リ ペプチ ドを採取す る こ と を特徴 と す る ポ リ ペ プチ ドの 製造法。
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    法律状态:
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    1986-07-03| AL| Designated countries for regional patents|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): CH FR GB IT NL SE |
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